腺病毒介導的SSTR2抑制胰腺癌生長轉移及其作用機制的實驗研究.pdf

1、第一部分：EphA2與E-cadherin在胰腺癌中的表達及意義 目的：探討EphA2和E-cadherin在胰腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系及兩種蛋白表達的相關性 方法：采用免疫組織化學SP方法，檢測56例胰腺癌及23例癌旁組織中EphA2和E-cadherin的表達，并分析其與臨床病理因素的關系。采用RT-PCR檢測EphA2在胰腺癌細胞株BxPc-3，PC-3及Panc-1中的表達。 結論：EphA2與

2、E-cadherin的表達可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉移；聯(lián)合檢測兩種蛋白對于胰腺癌轉移潛能的判斷具有一定的參考價值。 第二部分：腺病毒AdvCMV.SSTR2的構建及穩(wěn)定表達SSTR2的胰腺癌細胞的建立與培養(yǎng) 目的：利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構建攜帶人生長抑素受體Ⅱ型(SSTR2)基因的重組腺病毒AdCMV.SSTR2并在293細胞中擴增，制備重組病毒。建立能穩(wěn)定表達SSTR2蛋白的人胰腺癌細胞，為研究SSTR2

3、對胰腺癌細胞的作用奠定實驗基礎。 方法： 1.自人SSTR2真核表達載體pGEM-3Z-hSSTR2中酶切出SSTR2基因，插入pAdtrackCMV中構建成腺病毒穿梭質粒pAdtrackCMV-SSTR2，經(jīng)酶切線性化后，轉化包含腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的BJ5183菌，挑選同源重組質粒，酶切線性化重組質粒并轉染293細胞包裝成重組病毒顆粒。重組病毒上清感染293細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達。 2

4、.用AdCMV.SSTR2分別感染胰腺癌細胞BxPc-3，PC-3及Panc-1。于48小時、96小時在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，判斷轉染效率。并采用RT-PCR、WesternBlot方法檢測轉染前、轉染后胰腺癌細胞SSTR2的表達。 結論：成功地構建了攜帶SSTR2基因的重組腺病毒載體，并建立了能穩(wěn)定高表達SSTR2蛋白的人胰腺癌BxPc-3，PC-3及Panc-1細胞，為研究SSTR2對胰腺癌細胞增殖、轉移作用奠定了實

5、驗基礎。 第三部分：SSTR2基因對胰腺癌細胞生長侵襲影響的體外研究 目的：探討腺病毒介導的生長抑素受體2(SSTR2)基因對胰腺癌細胞BxPc-3生長、轉移的抑制作用及其機制。 方法：利用腺病毒載體AdvCMV.SSTR2將人類SSTR2全長cDNA導入胰腺癌細胞株BxPc-3，用RT-PCR及Westen-blot檢測SSTR2在mRNA水平及蛋白水平上的表達。流式細胞儀分別測定實驗組細胞(轉染AdvCMV.

6、SSTR2)、空載體對照組細胞(轉染空載體)及陰性對照組細胞(未轉染)的凋亡指數(shù)(AI)；MTT法分別檢測3組細胞的增殖情況；利用Transwell小室測定3組細胞細胞的穿膜侵襲運動能力；RT-PCR檢測轉染SSTR2前后及轉染空載體細胞的MMP-2、TIMP-2及EphA2的表達。 結論：轉染SSTR2可明顯抑制胰腺癌細胞的生長轉移，其可能的機制是通過改變MMP-2/TIMP-2的比例、降低EphA2的表達而起作用。

7、第四部分：SSTR2基因對胰腺癌生長轉移的抑制作用的體內研究 目的：探討奧曲肽聯(lián)合SSTR2基因轉染對裸鼠人胰腺癌移植瘤生長、轉移的抑制作用及其機制。 方法：利用腺病毒AdvCMV.SSTR2感染胰腺癌細胞BxPc-3，建立穩(wěn)定表達SSTR2的BxPc-3。分別將表達SSTR2的BxPc-3細胞(實驗組)和空載體對照組及陰性對照組的BxPc-3細胞異種移植到無胸腺小鼠體內，建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型。實驗組裸鼠成瘤后，每

8、兩周瘤體內注射AdvCMV.SSTR2繼續(xù)進行體內轉染，并且開始尾靜脈注入奧曲肽(250μg/kg)，每兩天一次，共用7周。移植后第8周處死動物，比較3組裸鼠之間胰腺腫瘤的大小和重量；用RT-PCR及Westen-blot檢測SSTR2在mRNA水平及蛋白水平上的表達；TUNEL法檢測胰腺癌細胞凋亡指數(shù)(AI)；RT-PCR檢測各組腫瘤組織MMP-2、TIMP-2以及EphA2的表達情況；并觀察荷瘤鼠淋巴結、肝臟腫瘤轉移情況。