腺病毒介導(dǎo)的SSTR2抑制胰腺癌生長轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：EphA2與E-cadherin在胰腺癌中的表達(dá)及意義 目的：探討EphA2和E-cadherin在胰腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性 方法：采用免疫組織化學(xué)SP方法，檢測56例胰腺癌及23例癌旁組織中EphA2和E-cadherin的表達(dá)，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系。采用RT-PCR檢測EphA2在胰腺癌細(xì)胞株BxPc-3，PC-3及Panc-1中的表達(dá)。 結(jié)論：EphA2與

2、E-cadherin的表達(dá)可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移；聯(lián)合檢測兩種蛋白對于胰腺癌轉(zhuǎn)移潛能的判斷具有一定的參考價(jià)值。 第二部分：腺病毒AdvCMV.SSTR2的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)SSTR2的胰腺癌細(xì)胞的建立與培養(yǎng) 目的：利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶人生長抑素受體Ⅱ型(SSTR2)基因的重組腺病毒AdCMV.SSTR2并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，制備重組病毒。建立能穩(wěn)定表達(dá)SSTR2蛋白的人胰腺癌細(xì)胞，為研究SSTR2

3、對胰腺癌細(xì)胞的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.自人SSTR2真核表達(dá)載體pGEM-3Z-hSSTR2中酶切出SSTR2基因，插入pAdtrackCMV中構(gòu)建成腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrackCMV-SSTR2，經(jīng)酶切線性化后，轉(zhuǎn)化包含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183菌，挑選同源重組質(zhì)粒，酶切線性化重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組病毒顆粒。重組病毒上清感染293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)。 2

4、.用AdCMV.SSTR2分別感染胰腺癌細(xì)胞BxPc-3，PC-3及Panc-1。于48小時、96小時在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，判斷轉(zhuǎn)染效率。并采用RT-PCR、WesternBlot方法檢測轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞SSTR2的表達(dá)。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了攜帶SSTR2基因的重組腺病毒載體，并建立了能穩(wěn)定高表達(dá)SSTR2蛋白的人胰腺癌BxPc-3，PC-3及Panc-1細(xì)胞，為研究SSTR2對胰腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移作用奠定了實(shí)

5、驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分：SSTR2基因?qū)σ认侔┘?xì)胞生長侵襲影響的體外研究 目的：探討腺病毒介導(dǎo)的生長抑素受體2(SSTR2)基因?qū)σ认侔┘?xì)胞BxPc-3生長、轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制。 方法：利用腺病毒載體AdvCMV.SSTR2將人類SSTR2全長cDNA導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞株BxPc-3，用RT-PCR及Westen-blot檢測SSTR2在mRNA水平及蛋白水平上的表達(dá)。流式細(xì)胞儀分別測定實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染AdvCMV.

6、SSTR2)、空載體對照組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染空載體)及陰性對照組細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染)的凋亡指數(shù)(AI)；MTT法分別檢測3組細(xì)胞的增殖情況；利用Transwell小室測定3組細(xì)胞細(xì)胞的穿膜侵襲運(yùn)動能力；RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染SSTR2前后及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的MMP-2、TIMP-2及EphA2的表達(dá)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染SSTR2可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移，其可能的機(jī)制是通過改變MMP-2/TIMP-2的比例、降低EphA2的表達(dá)而起作用。

7、第四部分：SSTR2基因?qū)σ认侔┥L轉(zhuǎn)移的抑制作用的體內(nèi)研究 目的：探討奧曲肽聯(lián)合SSTR2基因轉(zhuǎn)染對裸鼠人胰腺癌移植瘤生長、轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制。 方法：利用腺病毒AdvCMV.SSTR2感染胰腺癌細(xì)胞BxPc-3，建立穩(wěn)定表達(dá)SSTR2的BxPc-3。分別將表達(dá)SSTR2的BxPc-3細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)和空載體對照組及陰性對照組的BxPc-3細(xì)胞異種移植到無胸腺小鼠體內(nèi)，建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤后，每

8、兩周瘤體內(nèi)注射AdvCMV.SSTR2繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，并且開始尾靜脈注入奧曲肽(250μg/kg)，每兩天一次，共用7周。移植后第8周處死動物，比較3組裸鼠之間胰腺腫瘤的大小和重量；用RT-PCR及Westen-blot檢測SSTR2在mRNA水平及蛋白水平上的表達(dá)；TUNEL法檢測胰腺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；RT-PCR檢測各組腫瘤組織MMP-2、TIMP-2以及EphA2的表達(dá)情況；并觀察荷瘤鼠淋巴結(jié)、肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移情況。