NF-H在糖尿病大鼠胼胝體的表達及與認知障礙研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)病變是1型糖尿病和2型糖尿病的主要并發(fā)癥之一，人類把越來越多的精力投入到周圍神經(jīng)病的病因學和病理學研究中，而對中樞神經(jīng)病變只有簡單的描述。近年來，由糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害日益受到人們的重視。中樞神經(jīng)病變以腦電傳導速度的下降、腦組織萎縮、認知能力減退、和卒中風險升高為特征。許多研究顯示糖尿病增加了阿爾茨海默病和其他類型癡呆的風險。目前對糖尿病引起的認知功能障礙的發(fā)病機制尚不清楚，亦缺乏有效的防治手段。
　　早在40多年

2、前就有學者提出糖尿病腦病的概念，但至今尚無此病的診斷標準和特異性輔助檢查手段；其臨床主要表現(xiàn)為學習能力、記憶力、理解判斷力、表達能力等下降。這種糖尿病相關的認知功能障礙可能是由于持續(xù)的高血糖直接損傷腦組織神經(jīng)細胞引起，隨著病程的延長，各種致病因素將參與進來共同作用，加劇認知障礙的進展。目前研究證實葡萄糖的多元醇通路激活(polyol pathway)、氧化應激、非酶促糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end prod

3、ucts，AGEs)堆積、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活、己糖胺途經(jīng)激活、低度炎癥狀態(tài)、血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、肌醇耗竭、Na+，K+-ATPase活性降低、游離脂肪酸代謝異常、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、血液凝固及纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性異常等各種相關因素相互影響引起神經(jīng)細胞功能紊亂，從而導致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。
　　完整的神經(jīng)網(wǎng)絡結構是執(zhí)行一切功能的基礎。神經(jīng)網(wǎng)絡通路越完整，其信息傳送量越大，越有利于功能的完成。神

4、經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF)是神經(jīng)元的骨架蛋白，構成神經(jīng)通訊網(wǎng)絡的基本結構；胼胝體是連合左右半球新皮質的聯(lián)合纖維，主要與基本的認知能力有關，包括記憶力、注意力、表達能力和智力等，胼胝體前部(額區(qū))主要聯(lián)系兩側額葉，有資料顯示大腦額葉皮質是與學習和記憶功能較為密切的區(qū)域。
　　因此，我們推測NF-H在糖尿病大鼠胼胝體前部的表達會有變化并可能和認知功能的障礙程度有一定的相關性。
　　目的：本實驗采用空腹腹腔單次注

5、射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法，建立SD大鼠糖尿病模型，觀察高分子量神經(jīng)絲蛋白(high-neurofilament，NF-H)在實驗性糖尿病大鼠模型胼胝體前部的表達變化情況，觀察糖尿病大鼠胼胝體前部的病理學改變及超微結構變化，觀察糖尿病大鼠的認知功能損害，進一步對不同病程時間點各指標作相關性分析，探討糖尿病相關認知功能損害的發(fā)病機制。
　　方法：(1)實驗分組：采用健康成年雄性Sprague-Dawl

6、ey大鼠，隨機分為2組：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導糖尿病組(DM組)和對照組(CON組)。每組按照模型建立成功后的時間分為4周、7周、10周、13周4個亞組。(2)模型制備：DM組大鼠禁食12小時后給予腹腔內(nèi)注射以STZ65mg/kg體重，72小時出現(xiàn)多飲、多食、多尿，非空腹血糖≥16.7mmol/L者表示造模成功。CON組腹腔內(nèi)注射等體積pH4.0的檸檬酸緩沖液。(3)取材及樣品制備：①蠟塊樣品制備：各亞組

7、大鼠在相應的時間點行Morris水迷宮實驗、稱重、測血糖后，麻醉，以4％多聚甲醛全身灌流固定，斷頭取腦，后固定，石蠟包埋，改良三色法特殊染色，免疫組織化學法檢測NF-H的表達；②電鏡樣品制備：以4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合液灌流固定，斷頭取腦，取1mm3大小胼胝體前部組織立即放于4％戊二醛固定，之后經(jīng)1％餓酸后固定，丙酮脫水、浸透，包埋，半薄切片定位分析，超薄切片，醋酸鈾.枸櫞酸鉛電子染色，透射電鏡(JEM-1230型)觀察并拍照。

8、(4)Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力，改良三色染色法觀察胼胝體病理學改變，免疫組織化學染色觀察NF-H表達情況，電鏡觀察胼胝體神經(jīng)纖維的超微結構改變。(5)統(tǒng)計分析：實驗結果以均值±標準差(x-±S)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用獨立樣本的T檢驗、單因素方差分析(one-way ANOVA)，重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，Pearson線性相關分析等統(tǒng)計學方法，檢驗水準取a=0.05。
　　結果：

9、>　　1、各亞組DM組大鼠較相應CON組大鼠體重水平顯著降低；各亞組DM大鼠較相應CON組大鼠血糖水平顯著升高；
　　2、10周組中DM組大鼠較CON組大鼠的潛伏期時間顯著延長；DM組中7周組、10周組分別較4周組潛伏期時間顯著延長、搜索策略評分顯著降低；7周組、10周組中DM組分別較CON組的搜索策略評分、平臺穿越次數(shù)和站臺周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動時間顯著減少；Morris水迷宮實驗成績在CON組各亞組大鼠之間比較無顯著性差異。

10、r>　　3、(1)改良三色染色法：CON組大鼠胼胝體前部神經(jīng)纖維結構未見破壞，DM4周時神經(jīng)纖維結構破壞不明顯，其他DM組均可見神經(jīng)軸突和髓鞘不同程度的破壞，結構層次紊亂，表現(xiàn)為軸突稀疏、增粗、著色不均減少、排列松散不規(guī)整，神經(jīng)髓鞘著色減少、大量空泡形成。(2)透射電鏡觀察：CON組大鼠胼胝體前部神經(jīng)纖維結構未見破壞，DM組均可見神經(jīng)軸突和髓鞘不同程度的破壞，結構層次紊亂，疏松或崩解。表現(xiàn)為不同程度的髓鞘松散，軸索萎縮、固縮。
　

11、　4、NF-H的表達在各亞組DM組大鼠較相應CON組大鼠顯著降低；DM組中10周組和13周組分別較4周組和7周組顯著降低；CON組各亞組間比較無顯著差異。
　　5、NF-H的表達與病程具有顯著相關性(r=-0.983，p=0.017)；潛伏期、搜索策略評分、平臺穿越次數(shù)和站臺周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動時間與病程無顯著相關性(p>0.05)；NF-H的表達分別與潛伏期、搜索策略評分、平臺穿越次數(shù)和站臺周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動時間無顯著相關性(