以RUNX3為靶點干預(yù)低氧誘導(dǎo)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化.pdf

1、目的：
　　1、研究低氧對人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HCMECs）間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響；
　　2、HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中TGF-β信號通路及Notch信號通路的變化；
　　3、RUNX3敲減對HCMECs的功能及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響及具體機(jī)制。
　　方法：
　　1、研究低氧對 HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。實驗分組 Normoxia組：常氧（21％O2、5%CO2、74%N2，37℃）條件下培養(yǎng)HCMECs；Hy

2、poxia組：低氧（1%O2、5%CO2、94%N2，37℃）培養(yǎng)HCMECs，兩組細(xì)胞分別于培養(yǎng)1天、4天、5天（用H1、H4、H5表示）。進(jìn)行如下實驗：⑴光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；⑵免疫熒光雙標(biāo)染色，在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA強(qiáng)度變化及CD31＋/αSMA＋雙陽性細(xì)胞（代表正在發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞），并計數(shù)分析；⑶RT-PCR法測定各組細(xì)胞中CD31、VE-cadherin、αSMA及FSP-1 mRNA含量

3、并比較。
　　2、研究低氧誘導(dǎo)HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中TGF-β及Notch信號通路的變化，RUNX3敲減對HCMECs的功能及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。實驗分組Control組：常氧條件下培養(yǎng)HCMECs。Hypoxia組：低氧條件下培養(yǎng)HCMECs4天。RUNX3組：常氧條件下培養(yǎng)HCMECs，鋪板過夜后轉(zhuǎn)染RUNX3-RNAi慢病毒，低氧培養(yǎng)4天。GFP組：常氧條件下培養(yǎng)HCMECs，鋪板過夜后轉(zhuǎn)染空載體慢病毒，低氧培養(yǎng)4天。各

4、組細(xì)胞進(jìn)行如下實驗：⑴免疫熒光雙標(biāo)染色，在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA強(qiáng)度變化及CD31＋/αSMA＋雙陽性細(xì)胞（代表正在發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞），并計數(shù)分析；⑵應(yīng)用Transwell遷移實驗對各組HCMECs遷移能力進(jìn)行檢測；⑶應(yīng)用小管形成實驗對各組HCMECs血管新生能力進(jìn)行檢測并比較；⑷RT-PCR法測定各組細(xì)胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、TGF-β1、Smad2、Smad3、No

5、tch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail的mRNA含量并比較；⑸Western blot法測定各組細(xì)胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、Notch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白含量并比較。
　　結(jié)果：
　　1、低氧對HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響：
　　⑴光學(xué)顯微鏡可見：與Normoxia組比較，Hypoxia組HCM

6、ECs細(xì)胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，失去了鋪路石樣或鵝卵石樣結(jié)構(gòu)，逐漸呈長梭形或紡錘形生長。
　　⑵免疫雙標(biāo)熒光染色結(jié)果顯示：隨著低氧時間延長，Hypoxia組 HCMECs中CD31強(qiáng)度逐漸減弱，αSMA強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其中H4組CD31＋/αSMA＋雙陽性細(xì)胞最多（P<0.01）。
　?、荝T-PCR結(jié)果顯示：Hypoxia組HCMECs中CD31、VE-cadherin的mRNA表達(dá)降低，αSMA、FSP-1的mRNA表達(dá)升高

7、（P<0.05）。
　　2、敲減RUNX3基因?qū)CMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響：
　　⑴免疫雙標(biāo)熒光染色結(jié)果顯示：與GFP組相比，RUNX3組HCMECs中的CD31強(qiáng)度增強(qiáng)，αSMA強(qiáng)度減弱。
　?、芌T-PCR及Western Blot結(jié)果顯示：與Hypoxia組相比，RUNX3組細(xì)胞的CD31、VE-Cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)而αSMA、FSP-1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。
　　

8、3、敲減RUNX3基因?qū)CMECs功能的影響：
　?、判」苄纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示：低氧促進(jìn)HCMECs血管成型，而RUNX3敲減后進(jìn)一步促進(jìn)血管成型（P<0.05）。
　?、芓ranswell遷移實驗結(jié)果顯示：低氧促進(jìn)HCMECs遷移，RUNX3敲減后部分抑制了HCMECs遷移能力（P<0.05）。
　　4、HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中TGF-β信號通路的變化：
　?、臨T-PCR結(jié)果顯示：低氧激活了TGF-β信號通

9、路，Hypoxia組的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RUNX3敲減后TGF-β1mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增高，而Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　?、芖estern Blot檢測顯示：低氧促進(jìn)Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)（P<0.05）；RUNX3敲減后是Smad2/3、P-smad2/3蛋白表達(dá)均下調(diào)

10、（P<0.05），且p-Smad2/3下降比例更大（P<0.05）。
　　5、HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中Notch信號通路的變化：
　　RT-PCR及Western Blot檢測結(jié)果顯示：低氧同時激活了Notch信號通路， Hypoxia組的Notch-1、Slug、Snail、Hes1、Hey1 mRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RUNX3敲減后Notch-1上調(diào)更明顯，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化主要轉(zhuǎn)錄因

11、子 Slug、Snail均不同程度下調(diào)，同時 Hes1、Hey1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、低氧能誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，同時促進(jìn)血管新生及細(xì)胞遷移；
　　2、TGF-β信號通路及 Notch信號通路均上調(diào)，提示兩信號通路在低氧誘導(dǎo)HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中起重要作用；
　　3、RUNX3低表達(dá)減輕低氧誘導(dǎo)HCMECs間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，RUNX3低表達(dá)部分抑制了