2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分自噬對缺氧誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)及機制
  目的:
  1、研究缺氧對人心臟微血管內(nèi)皮細胞( human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT)及自噬的影響;
  2、研究自噬對缺氧誘導(dǎo)的HCMECs EndMT的影響及具體機制。

2、  方法:
  1、探究缺氧狀態(tài)下對 HCMECs EndMT的影響。實驗主要分為2組①control組:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)條件下培養(yǎng) HCMECs3天;②hypoxia組:缺氧(1%O2、5%CO2、74%N2,37℃)條件下培養(yǎng) HCMECs3天,分別對兩組細胞進行如下實驗:⑴光學(xué)顯微鏡下觀察兩組細胞形態(tài)學(xué)變化;⑵RT-PCR測定各組細胞中 CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1及

3、Snail mRNA相對表達水平;⑶Western blot測定兩組細胞CD31、E-Cadherin、ɑSMA、FSP-1、Snail蛋白表達水平;⑷雙重免疫熒光染色觀察 CD31、αSMA及FSP-1表達變化及并對CD31+αSMA+/FSP+雙陽性細胞(說明正在發(fā)生EndMT的細胞)和CD31-SMA+/FSP+細胞(說明已經(jīng)發(fā)生EndMT的細胞)計數(shù)分析。
  2、探究缺氧狀態(tài)下HCMECs自噬水平的變化。⑴HCMECs缺

4、氧3天內(nèi)LC3蛋白的表達動態(tài)變化,通過Western blot法測定HCMECs缺氧0,2,4,6,12,24,48,72 h處LC3表達變化;⑵將細胞分為以下4組:①control組:常氧條件下培養(yǎng) HCMECs;②氯喹(Chloroquine,CQ)(20μm)組:常氧條件下加入氯喹處理 HCMECs8小時;③hypoxia組:缺氧條件下培養(yǎng) HCMECs6小時;④hypoxia+CQ(20μm)組:常氧條件用氯喹處理HCMECs2

5、小時,缺氧培養(yǎng)6小時;Western blot法分別測定各組 LC3表達變化;⑶轉(zhuǎn)染 GFP-LC3質(zhì)粒的HCMECs在缺氧3天內(nèi)GFP-LC3表達動態(tài)變化,通過激光共聚焦觀察HCMECs缺氧0,2,6,12,24,36,48,72 h處GFP-LC3表達變化。
  3、探究缺氧狀態(tài)下自噬對HCMECs EndMT的影響及相關(guān)機制。實驗主要分為以下5組①control組:常氧條件下培養(yǎng) HCMECs3天;②hypoxia組:缺氧條

6、件下培養(yǎng) HCMECs3天;③hypoxia+雷帕霉素(rapmycin,rap)(100nm)組:雷帕霉素預(yù)處理細胞2小時,后將 HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天;④hypoxia+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(5mm)組:3-MA預(yù)處理細胞2小時,后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天;⑤hypoxia+CQ(20μm)組:氯喹預(yù)處理細胞2小時,后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天。分別對各組細胞進

7、行如下實驗:⑴雙重免疫熒光染色觀察CD31及αSMA表達變化并對CD31+αSMA+雙陽性細胞和CD31-SMA+細胞計數(shù)分析;激光共聚焦顯微鏡下觀察Snail及 LC3在 HCMECs的共定位;⑵RT-PCR測定各組細胞中 CD31、E-Cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、TGFβ2、Smad2及Smad3的 mRNA表達水平并比較分析;⑶Western blot測定各組細胞中CD31、E-cadherin、αSMA、

8、FSP-1、Snail、LC3、beclin1、TGFβ2、Smad2、p-Smad2、Smad3及p-Smad3蛋白表達并比較分析。
  結(jié)果:
  1、缺氧誘導(dǎo) HCMECs發(fā)生EndMT:
 ?、殴鈱W(xué)顯微鏡可見:control組HCMECs保持典型的鋪路石或鵝卵石樣內(nèi)皮細胞樣外觀;而缺氧狀態(tài)下細胞逐漸呈紡錘型樣變化,且隨時間變化愈明顯。
  ⑵RT-PCR結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組

9、HCMECs的CD31、E-cadherin mRNA表達下降,而αSMA、FSP-1及Snail mRNA表達升高(P<0.05)。
 ?、荳estern blot結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組 HCMECs的CD31、E-cadherin蛋白表達下降,而αSMA、FSP-1及Snail蛋白表達升高(P<0.05)。
 ?、入p重免疫熒光染色結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組 HCMECs

10、中CD31表達逐漸減弱,αSMA/FSP-1強度逐漸增強,CD31+αSMA+/FSP+雙陽性細胞明顯增加甚至出現(xiàn)CD31-SMA+/FSP+細胞(P<0.05)。
  2、缺氧誘導(dǎo) HCMECs發(fā)生EndMT:
 ?、臰estern blot結(jié)果顯示:當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時,在4小時處LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增加,12至24小時達高峰,隨著缺氧時間延長略有下降(P<0.05)。
 ?、苭estern blo

11、t結(jié)果示:相比于control組,hypoxia組和CQ組LC3 II增加,氯喹使缺氧狀態(tài)下LC3 II增加更顯著(P<0.05)。
 ?、荊FP-LC3斑點聚集試驗結(jié)果示:當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時,GFP-LC3熒光表達在約4-6小時開始開始由彌撒分布向聚集顆粒狀轉(zhuǎn)變,12小時至24小時這種聚集狀態(tài)升至高峰,隨著缺氧時間延長這種聚集改變下降,但仍高于對照組水平(P<0.05)。
  3、缺氧狀態(tài)下自噬對HCMECs E

12、ndMT的影響及相關(guān)機制:
 ?、烹p重免疫熒光染色結(jié)果顯示:相比hypoxia組,hypoxia+rap組CD31表達強度增加,αSMA表達強度下降,而hypoxia+3-MA/CQ組CD31表達強度進一步下調(diào),αSMA表達強度進一步增加。相比control組,hypoxia組Snail和LC3表達強度增加;相比hypoxia組,hypoxia+rap組LC3表達強度進一步增加和Snail表達強度下降,hypoxia+3-MA組L

13、C3表達強度下降和Snail表達強度增加, hypoxia+CQ組LC3和Snail表達強度都進一步增加(P<0.05)。
 ?、芌T-PCR結(jié)果顯示:相比hypoxia組,hypoxia+rap組TGFβ2、smad2、smad3及 Snail mRNA表達未見明顯改變,CD31、E-cadherin mRNA表達上調(diào),αSMA、FSP-1表達下調(diào)(P<0.05),hypoxia+3-MA/CQ組TGFβ2、smad2、smad

14、3及 Snail mRNA表達未見明顯改變,CD31、E-cadherin mRNA表達下降,αSMA、FSP-1表達上調(diào)(P<0.05)。
 ?、荳estern blot結(jié)果顯示:雷帕霉素增加了缺氧狀態(tài)下自噬相關(guān)蛋白LC3, beclin1的表達,抑制了缺氧誘導(dǎo)的CD31、E-cadherin的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào),3-MA和氯喹抑制了缺氧狀態(tài)下自噬的發(fā)生,進一步促進了缺氧引起的CD31、E-cadher

15、in的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào)(P<0.05)。缺氧狀態(tài)下,TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達上調(diào)(P<0.05);相比hypoxia組,缺氧聯(lián)合雷怕霉素、3-MA或氯喹后TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達均未見明顯改變。
  結(jié)論:
  1、缺氧能同時誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生EndMT及自噬;
  2、缺氧可通過激活TGF-β信號通路引起EndMT;
  3、缺氧誘導(dǎo)的自

16、噬對內(nèi)皮細胞具有保護性作用,可通過促進Snail降解抑制EndMT。
  第二部分自噬對心肌梗死后EndMT及心肌纖維化的調(diào)節(jié)及機制
  目的:
  探討在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后,通過干預(yù)自噬水平抑制EndMT進而減少心肌纖維化的的可行性。
  方法:
  取10周齡SD大鼠隨機分為以下4組①Sham組:不對大鼠冠狀動脈前降支進行結(jié)扎處理,余處理同A

17、MI組;②AMI組:對大鼠冠狀動脈前降支進行結(jié)扎處理;③AMI+rap(2 mg/kg/day):對大鼠冠狀動脈前降支進行結(jié)扎處理,隨即腹腔注射雷帕霉素,每天一次,持續(xù)14天;④AMI+3-MA(15 mg/kg/day):對大鼠冠狀動脈前降支進行結(jié)扎處理,隨即腹腔注射3-MA,每天一次,持續(xù)14天;分別對各組大鼠在各時間點進行如下實驗:⑴心肌梗死14天后心臟彩超觀察各組大鼠LVEF、LVFS、LVIDd及LVIDs變化并比較分析;⑵心

18、肌梗死14天后Masson’s trichrome染色檢測各組大鼠心肌膠原纖維化面積并比較分析;⑶心肌梗死7天后Western blot測定各組大鼠左室心肌梗死區(qū)域CD31、αSMA、COL1、LC3、beclin1的表達水平及比較分析;⑷心肌梗死7天后對左室心肌梗死區(qū)域雙重免疫熒光染色觀察CD31+αSMA+雙陽性細胞及血管內(nèi)皮細胞LC3的表達水平。
  結(jié)果:
 ?、糯笫笮呐K彩超結(jié)果顯示:SD大鼠心肌梗死14天后,LVI

19、Dd、LVIDs擴大, LVEF、LVFS減低;雷帕霉素抑制心肌梗死后LVIDd、LVIDs的擴大及LVEF、LVFS減低(P<0.05);3-MA并不能改善心肌梗死后心功能。
 ?、芃asson’s trichrome染色結(jié)果顯示:SD大鼠心肌梗死14天后,左室梗死區(qū)域纖維化顯著;雷帕霉素顯著減少心肌梗死后心肌纖維化面積;3-MA顯著增加心肌梗死后心肌纖維化面積(P<0.05)。
 ?、亲笫倚募」K绤^(qū)域western bl

20、ot結(jié)果顯示:LC3-II在心肌梗死后1天內(nèi)顯著上升,而后表達逐漸減低;心肌梗死7天后,CD31表達下降,αSMA、COL1表達增加,LC3、beclin1未見明顯改變;雷帕霉素增加了LC3及beclin1的表達,顯著抑制了心肌梗死后的CD31表達下降和αSMA、COL1表達增加;3-MA降低了LC3及beclin1的表達,進一步促進了心肌梗死后的CD31表達下降和αSMA、COL1表達增加(P<0.05)。
 ?、茸笫倚募」K绤^(qū)

21、域雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示:CD31+/αSMA+雙陽性細胞在心肌梗死后第7天明顯上升,雷帕霉素可明顯減少心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽性細胞,3-MA可增加心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽性細胞(P<0.05);心肌梗死后CD31陽性內(nèi)皮細胞LC3表達變化改變不明顯,雷帕霉素可增加心肌梗死后CD31陽性內(nèi)皮細胞LC3表達水平,3-MA可減低心肌梗死后CD31陽性內(nèi)皮細胞LC3表達水平(P<0.05)。
  結(jié)論:

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