肌肉中calsarcin基因的差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，在肌肉中，calcirleurin是受Ca<'2+>信號活化的一種多功能信號酶，不僅其本身可介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且通過去磷酸化作用可對其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，將Ca<'2+>信號與其他第二信使的調(diào)節(jié)機(jī)制偶聯(lián)起來，調(diào)節(jié)肌肉中各種基因的表達(dá)，對肌肉發(fā)育有重要作用。Calsarcin家族是一個與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶結(jié)合的肌肉特異蛋白質(zhì)新家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的calsarcin家族成員有三個ca

2、lsarcin-1，calsarcin-2和calsarcin-3。其中，calsarcin-1 基因在心肌和骨骼肌慢肌纖維中特異表達(dá)，而calsarcin -2 和calsarcin -3 只在骨骼肌快肌纖維中特異表達(dá)。同時calsarcin還作為肌肉中Z-Disc的重要結(jié)構(gòu)蛋白而存在，因此calsarcin基因可能在肌纖維的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的重要，從而對豬肉品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)首先從豬的骨骼肌中克隆到了calsarc

3、in三個基因，對它們在染色體上的基因定位情況，肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，基因序列中的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了一系列分析，為進(jìn)一步研究該家族基因在豬的肌肉發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，并為其將來運(yùn)用于標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。另外，calsarcin 家族的三個基因分別在慢肌和快肌中特異表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)還從小鼠的calsarcin基因的啟動子作為研究模型，對造成這種差異表達(dá)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制做了初步的研究，考慮到與calsarcin發(fā)生互作的calcineuri

4、n在肌纖維的決定和分化中起到了關(guān)鍵作用，對calsarcin基因表達(dá)調(diào)控的研究也將為進(jìn)一步闡明快慢肌纖維的決定和分化的分子機(jī)理提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1) 從豬胚胎骨骼肌文庫中分離得到了豬calsarcin-1 基因，利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的方法克隆得到了豬的calsarcin-2和calsarcin-3基因，對三個基因的mRNA序列以及蛋白預(yù)測序列進(jìn)行了初步分析。 2) 利用輻射雜種板技術(shù)分別將豬的 cal

5、sarcin-1，calsarcin-2和 calsarcin-3基因分別定位于豬的第8號，14號和2號染色體上。 3) 利用定量PCR技術(shù)檢測了calsarcin-1 和calsarcin-2 在不同組織以及不同發(fā)育時期的肌肉中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)calsarcin-1和calsarcin-2基因的組織表達(dá)規(guī)律類似，主要在肌肉中表達(dá)。而兩個基因的在肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律有顯著差異，calsarcin-1 基因在胚胎期的表達(dá)呈

6、下降趨勢，而calsarcin-2 基因的表達(dá)在同時期呈上升趨勢，兩者在出生后的表達(dá)都呈下降趨勢。 4) 構(gòu)建了豬calsarcin-1和calsarcin-2基因的綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，利用共聚焦顯微鏡對這兩個蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行了定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個融合蛋白主要都位于細(xì)胞核內(nèi)。 5) 在中外豬群中利用PCR-RFLP的方法分別對豬calsarcin-1和calsarcin-2基因的各一個SNP位

7、點(diǎn)進(jìn)行了判型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中外豬種在這兩個SNP位點(diǎn)的基因頻率上表現(xiàn)出較大差異。 6) 利用定量PCR檢測了小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個基因在細(xì)胞分化過程中都呈上調(diào)表達(dá)。 7) 利用GenBank中的小鼠基因組信息，用長片段PCR克隆得到了小鼠 calsarcin-1和calsarcin-2基因的啟動子序列，并將其連接到pGL3-basic報告基因載

8、體中，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)報告基因的活性顯著升高，證明了這兩個啟動子的有效性。利用啟動子分析軟件TESS對小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因啟動子中的可能的調(diào)控元件進(jìn)行了預(yù)測，然后構(gòu)建了各種缺失突變的報告基因載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)calsarcin-1啟動子中的一個可能的NFkB結(jié)合位點(diǎn)對該啟動子活性影響很大，而calsarcin-2啟動子中的預(yù)測的NFkB結(jié)合位點(diǎn)對該啟動子活性影響不大。 8) 凝膠阻滯電泳實(shí)

9、驗(yàn)證實(shí)了calsarcin-1啟動子中的NFkB結(jié)合位點(diǎn)和NFkB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，而預(yù)測的calsarcin-2啟動子中的NFkB結(jié)合位點(diǎn)并沒有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。 9) 利用NFkB轉(zhuǎn)錄因子的抑制藥物PDTC對該轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDTC能顯著抑制 calsarcin-1 啟動子的活性，而對calsarcin-2啟動子影響不大。 10) 利用NFkB，NFAT和MEF2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體和兩個啟動子共轉(zhuǎn)染，結(jié)