基于代謝組學(xué)的姜黃、郁金寒熱藥性差異研究.pdf

1、藥性是中藥的基礎(chǔ)和核心,一直是中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。中藥藥性作為中藥的重要特征,是對(duì)中藥化學(xué)成分作用于人體后產(chǎn)生的多種醫(yī)療作用和效果的高度概括。因此物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理效應(yīng)是中藥藥性的兩個(gè)本質(zhì)屬性。由于中藥來(lái)源廣泛,物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜,藥理效應(yīng)涉及多種方面,所以一直以來(lái)很難找到合適的研究對(duì)象和評(píng)價(jià)方法來(lái)研究中藥藥性。
　　 本課題選取姜黃、郁金為研究對(duì)像,是因?yàn)槎邅?lái)源于同一植物的不同藥用部位,而二者的寒、熱藥性卻相反,這樣使寒、熱藥性研

2、究更具有針對(duì)性和可比性。姜黃為姜科植物姜黃CurcumalongaL.的根莖,性溫,具有破血行氣、通經(jīng)止痛的功能。郁金為姜科植物姜黃CurcumalongaL.的塊根,性寒,具有行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃的功能。
　　 中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要來(lái)源于植物的次生代謝產(chǎn)物,姜黃、郁金作為同一植物的不同器官所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是否存在差異,差異如何是二者形成寒、熱藥性的根本因?yàn)?。因此本研究采用HPLC-DAD-MS和GC—MS分析技術(shù)

3、對(duì)姜科植物姜黃CurcumalongaL.的根莖(姜黃)和塊根(郁金)的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,采用模式識(shí)別技術(shù)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行比較,整體上評(píng)價(jià)二者次生代謝產(chǎn)物的異同,確定生物標(biāo)志物,從物質(zhì)基礎(chǔ)的角度說(shuō)明姜黃、郁金形成藥性差異的原因。
　　 “寒者熱之,熱者寒之”是中醫(yī)藥治療疾病的過(guò)程中對(duì)中藥藥性最樸素的認(rèn)識(shí)。姜黃、郁金的寒、熱藥性是其對(duì)不同癥候疾病作用后產(chǎn)生效果的高度概括。因此建立與臨床相適應(yīng)的病癥模型是評(píng)價(jià)姜黃、郁金藥理效應(yīng)的前

4、提,而選擇合理的評(píng)價(jià)方法則是闡釋二者寒、熱藥性差異的關(guān)鍵。臨床上姜黃、郁金最主要的用藥區(qū)別是二者分別用于治療陰黃證(濕寒黃疸)和陽(yáng)黃證(濕熱黃疸)。前期藥理實(shí)驗(yàn)證明在某些單一指標(biāo)上(如:黃疸指標(biāo)、抗氧化指標(biāo))姜黃、郁金對(duì)兩種寒熱模型具有不同的治療效果,但是同時(shí)在某些指標(biāo)上則無(wú)法體現(xiàn)二者的差異。為了從不同層次系統(tǒng)地評(píng)價(jià)姜黃、郁金的藥理效應(yīng),闡釋二者寒、熱藥性差異,我們嘗試采用代謝組學(xué)的研究方法整體上評(píng)價(jià)姜黃、郁金對(duì)兩種模型的作用效果,比較

5、其異同。
　　 主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 一、基于代謝組學(xué)研究方法的姜黃、郁金植物次生代謝產(chǎn)物差異研究
　　 1.建立了HPLC-DAD-MS分析方法,對(duì)姜黃、郁金樣品進(jìn)行了分析。在檢測(cè)波長(zhǎng)265nm下,建立了姜黃、郁金指紋圖譜,并采用主成份分析(PCA)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行處理,從二維主成份得分圖(ScoresPolt)可以看到姜黃、郁金樣品分別聚為兩類,說(shuō)明二者存在顯著差異,主成份載荷圖(LoadingPlot)為

6、我們提供了造成這種差異的生物標(biāo)志物群,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步t檢驗(yàn)確定了其中10種主要差異代謝產(chǎn)物,通過(guò)質(zhì)譜和紫外數(shù)據(jù)對(duì)其中7種進(jìn)行了鑒定,并進(jìn)行了相對(duì)含量的比較,姜黃中姜黃素cuncumin,去甲氧基姜黃素Demethoxycurcumin,雙去甲氧基姜黃素bisdemethoxycurcumin,雙氫姜黃素Dihydrocurcumin,芳姜黃酮Ar-turmerone,姜黃酮a,β-turmerone(或姜黃醇bisacumol),姜烯Zin

7、giberene(或沒(méi)藥烯β-Bisabolene、姜黃烯β-cureumene)的含量均高于郁金。
　　 2.建立GC-MS分析方法,對(duì)姜黃、郁金中萜類成分樣品進(jìn)行了分析。樣品制備采用石油醚索氏提取,保證了樣品制備的重復(fù)性。從氣質(zhì)色譜中鑒定了43個(gè)化學(xué)成分,基于這些成分采用主成份分析(PCA)比較姜黃、郁金二者的差異,從二維主成份得分圖(ScoresPolt)可以看到姜黃、郁金樣品分別聚為兩類,說(shuō)明二者存在顯著差異,主成份載荷

8、圖(LoadingPlot)為我們提供了造成這種差異的生物標(biāo)志物群,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步t檢驗(yàn)確定了其中14種差異代謝產(chǎn)物。
　　 3.通過(guò)以上兩種分析方法系統(tǒng)地對(duì)姜科植物姜黃CurcumalongaL.的根莖(姜黃)和塊根(郁金)的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)二者所含化合物的種類基本一致,主要為姜黃素類和萜類化合物；通過(guò)模式識(shí)別對(duì)姜黃、郁金進(jìn)行了區(qū)分,并確定了二者間的差異代謝產(chǎn)物。
　　 二、基于代謝組學(xué)的姜黃、郁金寒熱藥性評(píng)價(jià)

9、研究
　　 1.針對(duì)蛋白質(zhì)、糖類、脂肪代謝所產(chǎn)生的氨基酸、小分子有機(jī)酸、脂肪酸等目標(biāo)化合物,建立了血漿樣品的GC-MS衍生化分析方法。
　　 首先對(duì)寒濕黃疸和濕熱黃疸(以下分別簡(jiǎn)稱為寒證模型和熱證模型)進(jìn)行代謝輪廓分析,結(jié)合有監(jiān)督(PLS-DA)和無(wú)監(jiān)督(PCA)模式識(shí)別數(shù)據(jù)處理方法,能夠?qū)崿F(xiàn)寒、熱模型的識(shí)別,并確定了寒、熱模型的生物標(biāo)志物,其中寒證模型組與正常對(duì)照組比較,升高的標(biāo)志物有蘇氨酸、甘氨酸等,降低的標(biāo)志物有半

10、乳糖、檸檬酸等。熱證模型組與對(duì)照組比較,升高的標(biāo)志物有蘇氨酸、苯丙氨酸、半乳糖、檸檬酸、油酸等,降低的有丁二胺。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)姜黃、郁金的寒熱藥性奠定了基礎(chǔ)。
　　 針對(duì)寒證模型組,我們分析比較了姜黃、郁金、及主要差異代謝產(chǎn)物(姜黃素)干預(yù)前后代謝譜的變化。從PLS-DA得分圖上,我們可以從整體上看出各組動(dòng)物代謝譜變化的軌跡。姜黃素組和姜黃組距離寒證模型組距離最遠(yuǎn),郁金組與寒證模型組距離較近并有部分重合,說(shuō)明姜黃、姜黃素對(duì)寒證模型

11、代謝譜的調(diào)節(jié)作用大于郁金,這一點(diǎn)印證了“姜黃性溫”中醫(yī)理論,也說(shuō)明了姜黃素具有“溫性”的藥性。并且通過(guò)各給藥組與寒證模型組間的兩兩比較,進(jìn)一步確認(rèn)了藥物作用前后的差異代謝產(chǎn)物,與寒證模型的標(biāo)志物大部分一致且變化趨勢(shì)相反。
　　 針對(duì)熱證模型組,分析比較了姜黃、郁金、姜黃素干預(yù)前后代謝譜的的變化。從PLS-DA得分圖上,我們可以看到郁金組距熱證模型組的距離大于姜黃組。說(shuō)明郁金對(duì)熱證模型代謝的影響大于姜黃,反映出郁金具有“寒性”的性

12、質(zhì)。并且通過(guò)各給藥組與熱證模型組間的兩兩比較,進(jìn)一步確認(rèn)了藥物作用前后的差異代謝產(chǎn)物及變化趨勢(shì),大部分與熱證模型的標(biāo)志物相一致且變化趨勢(shì)相反。
　　 2.由于文獻(xiàn)報(bào)道單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與機(jī)體的寒、熱狀態(tài)密切相關(guān),因此針對(duì)此類物質(zhì),采用HPLC-(ESI)MS,建立了大鼠腦中7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝物色譜分析方法,并對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行了分析。
　　 首先對(duì)寒、熱證模型和正常對(duì)照組進(jìn)行比較,數(shù)據(jù)處理采用主成份分析,從主成份得分圖可以看

13、出正常對(duì)照組、寒證模型組,熱證模型組分別聚為3類,說(shuō)明寒、熱模型大鼠腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)存在差異,經(jīng)t-test檢驗(yàn),與正常對(duì)照組比較E,3-MT,和5-HT含量在熱證模型中均有顯著升高,寒證模型顯著降低。
　　 針對(duì)寒證模型,比較了姜黃、郁金、姜黃素對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響。經(jīng)主成份分析姜黃、姜黃素與寒證模型組區(qū)分顯著,姜黃給藥后明顯提高了寒證模型中E和5-HT的含量,姜黃素給藥后明顯提高了寒證模型中E、NE、5-HT,

14、降低了3-MT.而郁金與模型組比較各指標(biāo)均無(wú)顯著差異,說(shuō)明姜黃、姜黃素具有性溫的藥性。
　　 針對(duì)熱證模型,比較了姜黃、郁金、姜黃素對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響。經(jīng)主成份分析姜黃、郁金、姜黃素對(duì)熱證模型均有調(diào)節(jié)作用。姜黃、郁金給藥后降低了熱證模型中E、3-MT、5-HT、5-HIAA的含量,進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),郁金對(duì)上上述指標(biāo)的降低幅度要大于姜黃；姜黃素給藥后與熱證模型組在載荷圖上有部分重疊,與模型組比較,5-HT降低,DA升高。只是

15、在指標(biāo)的數(shù)量和調(diào)節(jié)的幅度上,郁金大于姜黃和姜黃素。
　　 3.通過(guò)建立以上兩種代謝組學(xué)分析方法,從不同的角度對(duì)濕熱黃疸和寒濕黃疸兩種寒熱模型進(jìn)行了研究,確定了二者的生物標(biāo)志物,并在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)姜黃、郁金、姜黃素對(duì)寒、熱模型的不同作用,從整體上說(shuō)明三者作用的差異,進(jìn)而從代謝組學(xué)的角度闡釋姜黃、郁金寒、熱藥性。
　　 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1、研究對(duì)象新穎,可比性強(qiáng)。選擇來(lái)源于同種植物不同部位的郁金和姜黃為研究對(duì)象,

16、兩者遺傳背景、環(huán)境因素相同,且炮制方法相同,盡可能地保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。
　　 2、采用代謝組學(xué)的研究方法系統(tǒng)的比較了姜黃、郁金作為同一植物不同部位所含有的次生代謝產(chǎn)物的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物標(biāo)志物,說(shuō)明了二者藥性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3、建立了GC-MS血漿代謝組輪廓分析和HPLC-MS大鼠腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分析的兩種代謝組學(xué)方法,并將該方法首次應(yīng)用到姜黃、郁金的藥性研究中。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析,確定了濕熱黃疸和寒濕