基于色譜技術(shù)的款冬植物代謝組學(xué)研究.pdf

1、選題依據(jù):款冬花為一種中醫(yī)臨床常用的止咳化痰藥，采用花序芽即未開放的花蕾作為藥用部位。其花序芽形成于栽種當(dāng)年秋季，于栽種當(dāng)年立冬前后，當(dāng)花蕾尚未出土、苞片呈紫紅色時采收，開花則是在來年早春。由于花序芽的發(fā)育是在無光照的地下進行的，較難觀察其整個發(fā)育過程，給花蕾的采收帶來了一定的困難，缺乏客觀合理的科學(xué)指導(dǎo)。在歐洲的藥典中，款冬花是以葉子為藥用部位入藥的，而國內(nèi)藥典則收載的是花蕾，兩者的異同有待于研究和分析。目前市售的中藥都存在著質(zhì)量參差

2、不齊的狀況，而款冬也不例外。市場上很多款冬花蕾中摻雜著一些花梗及根莖等非藥用部位，以次充優(yōu)。故急需對這些問題從科學(xué)的角度進行闡述和解釋。植物代謝組學(xué)技術(shù)則是研究植物體的整體代謝產(chǎn)物及其變化規(guī)律的一種新的系統(tǒng)生物學(xué)方法。它是采用具有高通量、高靈敏度和高精確度的現(xiàn)代分析測試技術(shù)，對植物樣品的代謝產(chǎn)物的異同和變化進行探尋。除此之外，款冬中還存在著一類肝毒性吡咯里西啶生物堿，對不同款冬樣品中生物堿的含量研究也是個空白，對其進行含量測定及安全性評

3、價就顯得尤為重要。
　　目的:(1)建立基于GC-MS和UPLC的款冬植物代謝組學(xué)研究方法，比較不同樣品代謝物組的整體差異性，尋找到差異代謝產(chǎn)物，以確定藥材最佳采收期，科學(xué)闡釋中國和歐洲用藥部位不同的原因，以及明確非藥用部位作為雜質(zhì)的合理性。(2)建立基于UPLC的生物堿含量測定方法，以確定其用藥安全性;通過各個樣本進行比較分析，找出生物堿含量與藥效的關(guān)系。
　　方法:(1)采用溶劑提取法制備款冬不同產(chǎn)地、不同發(fā)育階段和不同

4、部位的樣品，分別對其進行GC-MS和UPLC分析，獲得指紋圖譜;GC-MS代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)指認通過NIST數(shù)據(jù)庫檢索和標(biāo)準(zhǔn)品對照確定，而UPLC的代謝產(chǎn)物則是通過對照品和文獻進行指認。之后將數(shù)據(jù)預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，得到相應(yīng)的得分圖和載荷圖，得分圖是對不同組別進行分類比較;載荷圖用來尋找引起組間差異的代謝物。
　　(2

5、)對款冬花不同產(chǎn)地、不同發(fā)育階段、不同器官以及含款冬的中藥復(fù)方進行了生物堿的提取，通過UPLC技術(shù)對其進行含量測定，比較不同樣本中的生物堿含量高低。
　　結(jié)果:(1) GC-MS和UPLC代謝組學(xué)分析結(jié)果:成功建立了款冬花GC-MS和UPLC兩種分析方法，共指認得到了54種初級代謝產(chǎn)物和18種次級代謝產(chǎn)物。不同產(chǎn)地款冬花的分析結(jié)果:PCA分析顯示山西產(chǎn)地野生品聚為一類，蜜炙樣品聚為一類，而其他產(chǎn)地栽培品聚在一起。不同發(fā)育階段款冬花

6、蕾的多元統(tǒng)計分析結(jié)果:不同發(fā)育階段的款冬樣品有很明顯的分開趨勢，且是逐步變化的，可以看出發(fā)育初期和開花后的款冬樣品位于得分圖的兩端，將這兩組樣品分別與位于中間的傳統(tǒng)藥用部位進行比較，其差異主要體現(xiàn)在9個初級代謝產(chǎn)物上和7個次級代謝產(chǎn)物上。不同器官款冬植物的多元統(tǒng)計分析結(jié)果:花蕾、根、葉子和花梗四個不同器官在得分圖中能明顯的分開，各自聚為一類。將根、葉子和花梗均與花蕾進行比較可以尋找得到每兩個組之間的差異代謝產(chǎn)物。
　　(2)對款冬

7、生物堿進行提取分離，得到腎形千里光堿（senkirkine）單體。并且采用UPLC對其進行含量測定。不同產(chǎn)地研究結(jié)果顯示山西、河北和甘肅產(chǎn)地的生物堿含量均在90μg/g以上，其他產(chǎn)地則較低，而蜜炙樣品的含量在80μg/g以下;不同發(fā)育階段研究結(jié)果顯示senkirkine含量逐漸升高，在12月份升至最高，開花后又降低;不同器官研究結(jié)果顯示葉子中的senkirkine含量最高，花蕾次之，花梗和根中的senkirkine含量相對較低。含款冬的

8、不同中成藥中均沒有檢測到senkirkine。
　　結(jié)論:(1)本實驗成功地建立了基于GC-MS和UPLC分析技術(shù)的款冬植物代謝組學(xué)方法，從整體化學(xué)角度對不同產(chǎn)地、不同發(fā)育階段和不同器官的款冬樣品進行分析和評價。不同產(chǎn)地結(jié)果顯示:山西產(chǎn)地野生品種與甘肅、河北等產(chǎn)地栽培品有明顯不同，蜜炙樣品與生品差異也較大。不同發(fā)育階段結(jié)果顯示:在花蕾發(fā)育形成過程中，初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物都發(fā)生了明顯的變化，但是其中的規(guī)律還有待于更加深入的探尋

9、;不同器官結(jié)果顯示:歐洲藥用部位葉子與中國傳統(tǒng)藥用部位花蕾所含的化合物較多，而根和花梗中化學(xué)成分較少。這為款冬的質(zhì)量評價提供了新的思路和方法。
　　(2)成功建立了款冬中senkirkine含量測定的UPLC分析方法，并對不同產(chǎn)地、不同發(fā)育階段、不同器官款冬和含款冬的市售中成藥都進行了senkirkine的含量測定。不同產(chǎn)地結(jié)果顯示:山西、河北和甘肅等主產(chǎn)地的senkirkine含量最高，東北、青海和河南等非主產(chǎn)地的senkirk

10、ine含量較低，說明senkirkine可以作為主產(chǎn)地與非主產(chǎn)地判別以及款冬質(zhì)量及藥效評價的一個指標(biāo)，且蜜炙款冬senkirkine含量降低的原理尚不明確。不同發(fā)育階段結(jié)果顯示:senkirkine含量在花蕾采收時期較高，在花蕾發(fā)育初期和開花后含量均較低，表明款冬藥效成分含量和senkirkine的含量可能呈正相關(guān)。不同器官結(jié)果顯示:葉子與花蕾中的senkirkine也較花梗和根中的高，也驗證了款冬藥效和senkirkine的含量可能呈