基于代謝組學(xué)轉(zhuǎn)基因水稻差異性分析.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，種植面積不斷擴(kuò)大，關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的生物安全問(wèn)題，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。水稻是我國(guó)的主糧之一，同時(shí)也是研究較多的模式植物，起著非常重要的作用。本文以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了兩方面的研究:
　　1.對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻進(jìn)行分子特征鑒定的研究
　　(1)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻插入元件篩選。利用常規(guī)PCR技術(shù)，對(duì)15個(gè)插入元件進(jìn)行驗(yàn)證和篩選，確定插入序列有P-Ubi、Cry1Ab、T-35S、T-nos

2、等4個(gè)元件。
　　(2)序列拼接和插入片段全長(zhǎng)的獲得。根據(jù)獲得的3'端和5'端外源插入片段與水稻基因組的連接區(qū)，對(duì)插入片段的旁側(cè)序列進(jìn)行測(cè)定。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序和序列比對(duì)，確定了插入片段的全序列，并證明其位于水稻第5號(hào)染色體上18343369處。
　　(3)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻中外源插入序列拷貝數(shù)的測(cè)定。利用Southern blotting和微滴數(shù)字PCR兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻外源插入序列的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定。South

3、ern雜交結(jié)果顯示為單一條帶，微滴數(shù)字PCR結(jié)果顯示拷貝數(shù)平均值為0.97，兩種方法均證明外源插入基因的拷貝數(shù)為單拷貝。
　　2.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻代謝組學(xué)的研究
　　基于超高效液相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，應(yīng)用代謝組學(xué)策略，對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與其受體在代謝組學(xué)水平上做差異性比較。主要做了以下兩項(xiàng)工作:
　　(1)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻代謝組學(xué)方法的建立。通過(guò)試驗(yàn)確定了樣本提取溶劑的種類(lèi)和濃度。優(yōu)化了數(shù)據(jù)采集過(guò)程的色譜和質(zhì)譜方

4、法，確定了在數(shù)據(jù)分析方面的各項(xiàng)參數(shù)和色譜圖解析方法，建立了一套代謝組學(xué)水平上的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用轉(zhuǎn)基因水稻研究法。
　　(2)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻代謝差異性分析。試驗(yàn)主要研究了在水稻的幼苗期和分蘗期，相同生長(zhǎng)條件下的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與其受體組別差異。采用主成分分析和正交偏最小二乘法-判別法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，結(jié)果顯示正交偏最小二乘法分析模式比主成分分析模式的分組效果好，能夠?qū)山M樣本完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。運(yùn)用正交偏最小二乘法分析模式鑒定到了差異代

5、謝物及其在兩組樣本含量上的差別;研究了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與其受體的組別差異以及在代謝物含量上的差別;確定了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與其親受體標(biāo)志物。
　　本試驗(yàn)揭示了在水稻幼苗期和分蘗期兩個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與其受體在代謝產(chǎn)物上的變化，確定了超高效液相色譜柱的型號(hào)，流動(dòng)相的梯度洗脫程序，在正負(fù)兩種離子模式下的質(zhì)譜條件參數(shù)和水稻樣本提取溶劑濃度的選擇，建立了基于UPLC-Q/TOF-MS的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻代謝指紋譜的研究方法。在此方法的基礎(chǔ)上