低頻短時(shí)電刺激對(duì)周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生選擇性的影響和作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究周圍神經(jīng)損傷后，在失去靶器官聯(lián)系的條件下，短時(shí)、低頻電刺激對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生選擇性的影響并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠股神經(jīng)作為研究模型。在股神經(jīng)終末分支處近段造成神經(jīng)離斷傷，使用PGA(Polyglycolic Acid)神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)后進(jìn)行電刺激。神經(jīng)修復(fù)8周后通過(guò)熒光示蹤劑自股神經(jīng)終末感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)分支處進(jìn)行逆向示蹤，檢測(cè)電刺激對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生選擇性的影響。隨后再采用周圍神經(jīng)損傷模型，于神經(jīng)損傷修復(fù)

2、后3周（再生選擇性開始的時(shí)間）通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)及ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法檢測(cè)神經(jīng)再生路徑及靶器官中各種營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白及核酸水平。最后，通過(guò)神經(jīng)元原代培養(yǎng)、熒光免疫組化、Western Blot，激光掃描共聚焦(Laser ScanningConfocal)等方法研究與電刺激引發(fā)神經(jīng)元興奮性變化有密切關(guān)系的細(xì)胞內(nèi)Ca2+以及對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)具有重要作

3、用的MAPK信號(hào)通路分子Erk與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 ①．股神經(jīng)損傷后，63.47±2.29％的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)重新回到運(yùn)動(dòng)路徑中來(lái)。失去靶器官聯(lián)系后正確投射的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)比例下降到32.83±1.91%(P＜0.05)，再生神經(jīng)數(shù)量也下降(P＜0.05)。提示靶器官源性信號(hào)不僅對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的再生具有導(dǎo)向作用，也是神經(jīng)成功再生所不可缺少的。給予低頻電刺激后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生的選擇性明顯改善，86.84±5.64%

4、的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)正確投射到原來(lái)的運(yùn)動(dòng)路徑中來(lái)。即使在失去靶器官聯(lián)系后也有82.26±1.37%的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)進(jìn)行了正確的路徑選擇。盡管電刺激具有對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生選擇性的促進(jìn)作用，但是并不能改善再生神經(jīng)相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量。
　　 ②．ELISA結(jié)果提示，周圍神經(jīng)損傷后3周，遠(yuǎn)段神經(jīng)及腓腸肌中各類營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、GDNF、NT-3、NT-4)蛋白水平較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)。失去靶器官聯(lián)系后遠(yuǎn)端路徑中BDNF，GDNF以及NT-3

5、的蛋白水平較正常對(duì)照組升高，但其升高幅度較保留靶器官聯(lián)系組顯著降低(P＜0.05)。無(wú)靶器官聯(lián)系組BDNF及GDNF蛋白水平僅為保留靶器官聯(lián)系組含量的一半(P＜0.05)，提示失去靶器官聯(lián)系后，神經(jīng)再生路徑中的營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境惡化。電刺激后，損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端路徑中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的水平較單純損傷組顯著升高（除NT-4外）(P＜0.05)，并且不受靶器官聯(lián)系狀態(tài)的影響。與電刺激后遠(yuǎn)端路徑中各營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白水平升高不同，營(yíng)養(yǎng)因子的核酸水平并沒(méi)有顯著改變甚

6、至有所降低。
　　 ③．周圍神經(jīng)損傷后，電刺激可使脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元BDNF表達(dá)顯著升高，并且集中在前角大胞體的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。電刺激后體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元BDNF的表達(dá)也顯著升高(P＜0.05)。激光掃描共聚焦方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，電刺激培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的Ca2+水平進(jìn)行性升高，更換不含Ca2+的孵育液時(shí)消失，并且可以被電壓門控型Ca2+通道阻滯劑尼非地平所減弱。同時(shí)，免疫組化及Western blot結(jié)果提示尼非地平還能部分抑制電刺激后脊髓神

7、經(jīng)元BDNF的表達(dá)。此外，在體外培養(yǎng)體系中加入Erk的抑制劑后進(jìn)行電刺激神經(jīng)元BDNF的表達(dá)也受到抑制。
　　 結(jié)論：電刺激能夠不依賴于靶器官聯(lián)系的影響而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的選擇性再生。其機(jī)制可能是通過(guò)Ca2+-Erk依賴的信號(hào)通路促進(jìn)脊髓神經(jīng)元BDNF的表達(dá)，表達(dá)升高的營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)軸漿流動(dòng)運(yùn)輸?shù)綋p傷位點(diǎn)局部，改善該處的再生營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境，并作用于該處的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)路徑特異性的導(dǎo)向蛋白，促進(jìn)神經(jīng)的再生和識(shí)別正確的路徑信息，從而改善其再