2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后,損傷的軸突通常便失去了再生的能力。而成熟的周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)損傷后,在未傷及其靶組織的情況下,受損的軸突仍然能夠成功再生。 目前已經(jīng)證實,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生受限的主要障礙有兩種。一種是不利于膠質(zhì)細胞軸突生長的環(huán)境,其特點為髓鞘碎片,膠質(zhì)瘢痕,空化以及易化分子缺乏。另一種是損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元失去對有利于軸突再生的基因表達的控制。越來越多的證據(jù)表明,抑制信號的傳導(dǎo)過程有利于克服中樞神經(jīng)

2、的再生障礙,但必須與激活神經(jīng)細胞內(nèi)在生長狀態(tài)相結(jié)合,從而使軸突能夠成功再生。 背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)的初級感覺神經(jīng)元大量聚集形成神經(jīng)叢,成為適合對CNS以及PNS再生能力進行比較的細胞元群體。這些神經(jīng)元同時具有中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)的軸突。周圍神經(jīng)的神經(jīng)支受損傷后,可表現(xiàn)出旺盛的再生能力,最終實現(xiàn)功能性恢復(fù)。與之相反,中樞神經(jīng)的神經(jīng)支損傷后,其軸突的再生能力較差。 研究顯示,將成年小鼠或大鼠的坐骨神經(jīng)近端在其進一步損傷之前2

3、-28天壓碎或橫斷,軸突的再生能力增強,速度加快3倍。背柱橫切后,伴隨損傷而生長成為周圍神經(jīng)片段的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的中樞突數(shù)量增加了100倍。此外,1-2周前發(fā)生的周圍神經(jīng)損傷會導(dǎo)致中樞支在脊髓背柱損傷部位的內(nèi)外再生。因此,神經(jīng)生長能力的增強是條件性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元反應(yīng)的結(jié)果,與神經(jīng)細胞體中的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是當(dāng)前神經(jīng)損傷后軸突再生研究的熱點領(lǐng)域。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT3被許多細胞因子和生長因子激活而介導(dǎo)多種生理

4、過程。STAT3蛋白含有DNA結(jié)合域,SH2區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)等保守區(qū)域,通過705位酪氨酸的磷酸化而激活,形成二聚體,入核與特異DNA元件結(jié)合,啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。STAT3在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中有表達,并與其他信號途徑協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)前體細胞的分化命運,STAT3結(jié)合元件的甲基化狀態(tài)還決定了細胞的分化潛能。 STAT3蛋白還參與維持神經(jīng)細胞的存活和促進神經(jīng)損傷后的再生。已證明JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是在外周神經(jīng)細胞軸索切斷后被激

5、活的,并且它對神經(jīng)再生和神經(jīng)元存活是至關(guān)重要的。在外周神經(jīng)橫斷后,新生運動神經(jīng)元中STAT3蛋白表達顯著增加并可以被Tyr705磷酸化而激活。坐骨神經(jīng)損傷后的STAT3磷酸化能被持續(xù)從神經(jīng)束膜注入至最近神經(jīng)殘端的JAK2抑制物AG490所阻斷。在體外,神經(jīng)束膜注入的AG490能阻礙神經(jīng)軸突的增生,在條件損傷坐骨神經(jīng)后,AG490也能顯著降低成熟的成人脊髓中神經(jīng)元軸突再生。由此推斷:條件損傷后,STAT3的活化作用對提高傷后DRG感覺神經(jīng)

6、元生長能力是至關(guān)重要的。 細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)是可以抑制JA K/STA T信號通路的負(fù)調(diào)控因子。1997年以來,相繼發(fā)現(xiàn)SOCS家族的CIS和SOCS1~7共8個成員,其中SOCS3可與細胞因子受體相結(jié)合,使其在空間結(jié)構(gòu)上與JA Ks緊密相鄰,同時結(jié)合并抑制JA Ks激酶的活性,以抑制STA T3的磷酸化。大鼠周圍神經(jīng)損傷后,在其背根神經(jīng)節(jié)中檢測的SOCS3 mRNA表明了一個明顯的抑制作用。 病毒載體

7、是目前基因研究和治療中多采用的目的基因的轉(zhuǎn)移工具,腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒等病毒載體系統(tǒng)是應(yīng)用的比較多的。本研究使用的是慢病毒載體。慢病毒為非致癌性病毒,能感染多種臟器,其特點為持續(xù)時間長、潛伏期長的慢性感染,屬逆轉(zhuǎn)錄病毒家族。慢病毒的特點是在包膜基因和逆轉(zhuǎn)錄酶基因之間以及3’端包膜蛋白基因區(qū)含有開放性讀碼框,目前由人類免疫缺陷Ⅰ型病毒演變而來慢病毒是最常用的。為增加其安全性,以刪除vpr、vpu、nef、vif基因的質(zhì)粒

8、包裝慢病毒載體。構(gòu)建慢病毒載體時,在3’長末端重復(fù)系列的U3區(qū),通過刪除133bp堿基以達到病毒載體的自身滅活,而5’長末端重復(fù)系列的U3區(qū)以巨細胞病毒(CMV)啟動子取代。慢病毒能攜帶9kb容量的外源基因,對神經(jīng)元具有高度親嗜性,不具有逆向轉(zhuǎn)運的能力,作為表達載體在中樞系統(tǒng)研究中應(yīng)用非常理想。 此項研究的目的是構(gòu)建攜帶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT3和基因突變的雌激素受體ER的慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染受損的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,研究

9、其對神經(jīng)元突起再生的作用;通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)SOCS3和作用相反的突變的SOCS3(m SOCS3),體外研究SOCS3在成年鼠的初級感覺神經(jīng)元再生中的作用;探討STAT3和SOCS3在神經(jīng)元軸突再生中的相互作用及關(guān)聯(lián)性。 本實驗運用基因重組技術(shù),將STAT3、ER和核糖體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白(IRES-GFP)片段插入慢病毒載體pRRL-MCS+的PmeI位點構(gòu)建慢病毒載體pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,經(jīng)RT-PCR、

10、western blotting和測序分析加以鑒定其正確性。將慢病毒載體質(zhì)粒pRRL-SOCS3-IRES-GFP,pRRL-mSOCS3-IRES-GFP和pRRL-STAT3ER-IRES-GFP分別轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝慢病毒載體并測定滴度。切斷大鼠左L5近神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)根,摘取L5背根神經(jīng)節(jié)做分離神經(jīng)元培養(yǎng),陽性對照的大鼠,在搗碎背根前立即在髖部橫斷左側(cè)坐骨神經(jīng)(SN)。分別將三種慢病毒載體感染神經(jīng)元細胞,采用免疫熒光染色法觀察神

11、經(jīng)元細胞核質(zhì)反應(yīng)和突起的長度,通過實時PCR和原位雜交檢測DRG s中SOCS3mRNA的存在。 實驗結(jié)果是構(gòu)建的慢病毒載體pRRL-STAT3ER-IRES-GFP經(jīng)RT-PCR和western blotting鑒定正確;測序分析與Genbank報道的STAT3基因序列完全一致。三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后,測定慢病毒滴度為1010-11TU/ml。轉(zhuǎn)染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神經(jīng)元經(jīng)4-羥基三苯氧胺(4HT

12、)激活,STAT3ER有明顯的核轉(zhuǎn)運,并增強突起的生長,經(jīng)X2檢驗與對照組有顯著性差異。在神經(jīng)損傷后SOCS3 mRNA的濃度在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中明顯增加,外源性SOCS3能阻止神經(jīng)元中STAT3的磷酸化及核移位,mSOCS3增強了突起生長。 實驗結(jié)論: 1.成功構(gòu)建了表達小鼠STAT3ER基因的慢病毒載體。 2.證實了STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有利于軸突生長。 3.SOCS3通過抑制STAT3和/或其他轉(zhuǎn)導(dǎo)因子

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