脂質(zhì)體介導(dǎo)HBcAg基因轉(zhuǎn)染人樹突狀細胞的轉(zhuǎn)染效率及其功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的高危害性的疾病。1965年HBV作為人類感染的一種主要病原體發(fā)現(xiàn)于非白血性白血病病人和澳大利亞土著居民中?，F(xiàn)全世界將近有三分之一的人口感染HBV病毒，慢性HBV感染常常會導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭甚至肝細胞癌的發(fā)生。慢性乙型肝炎的治療藥物目前主要是干擾素α和核苷類似物，但兩者都不能清除cccDNA，故而停藥后病情往往會反復(fù)。 機體特異性細胞免疫應(yīng)答是清除病毒感染的關(guān)鍵。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)

2、是抗病毒免疫和抗腫瘤免疫的最為重要的效應(yīng)細胞，它們能夠識別細胞表面的MHC Ⅰ類分子遞呈的病毒或腫瘤相關(guān)抗原肽，從而清除病毒或殺傷腫瘤細胞。因此，誘導(dǎo)活化特異性CTL是臨床免疫治療的主要目標(biāo)。 樹突狀細胞作為機體內(nèi)最強大的抗原遞呈細胞，也是機體免疫反應(yīng)的始動者和調(diào)節(jié)者，它能夠通過MHCⅠ和MHC Ⅱ分子途徑遞呈抗原，在特異性體液和細胞免疫應(yīng)答中均發(fā)揮著十分重要的作用，并與慢性乙肝的發(fā)病機理和預(yù)后轉(zhuǎn)歸都有十分緊密的聯(lián)系。以DC為基

3、礎(chǔ)的免疫治療已成為慢性HBV感染和慢性乙型肝炎治療研究的一個新方向。為此，我們應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建人HBcAg核酸DC疫苗，以期能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更有效的特異性CTL免疫應(yīng)答。 目的：本文旨在研究以陽離子脂質(zhì)體為載體將HBcAg基因轉(zhuǎn)入人DC，構(gòu)建人HBcAg核酸DC疫苗，通過對其HBcAg的表達率，刺激自體淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ及其對HepG2.2.15細胞的殺傷能力的研究觀察，為今后HBcAg基因修飾的DC疫苗的臨床應(yīng)用

4、奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： 1．細胞的分離和培養(yǎng)：用HES離心沉淀法分離人外周血人外周血單個核細胞(PBMC)，經(jīng)粒一巨細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測其細胞表面分子標(biāo)志。 2．細胞轉(zhuǎn)染效率的測定：培養(yǎng)第5d以陽離子脂質(zhì)體為載體，將GFP報告基因(DNA：脂質(zhì)體比例為1:3、1:4、1:5、1:6)及HBcAg基因(DNA：脂質(zhì)體1:5

5、)導(dǎo)入人DC，于72h經(jīng)流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達率，于48、72、96、120h流式細胞儀檢測HBcAg的表達率。 3．轉(zhuǎn)染后細胞表面標(biāo)志的測定：細胞轉(zhuǎn)染48hs后收集DC，加入單克隆抗體抗人抗體 HLA-DR-FITC，CD86-PE、CDla-FITC、CD80-PE、CD83-FITC、CD40-PE，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組各種細胞表面分子的表達。 4．免疫熒光法檢測HBcAg的表達：轉(zhuǎn)染

6、的DC用冷丙酮固定30min，5％BSA室溫封閉1 h，加入鼠抗人HBcAg單克隆抗體室溫反應(yīng)1 h，蒸餾水洗滌3遍后加FITC熒光標(biāo)記的羊抗鼠單克隆抗體IgG室溫反應(yīng)45 min，熒光顯微鏡觀察細胞熒光。 5．混合培養(yǎng)：將DC分為轉(zhuǎn)染HBcAg基因組pJW4303/HBc-DC、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組pJW4303-DC、未轉(zhuǎn)染組DC三組，復(fù)蘇自體淋巴細胞，將淋巴細胞與三組DC均按照10:1的比例混合培養(yǎng)。 6．IFN-γ的測

7、定：分別將pJW4303/HBc-DC、pJW4303-DC及未轉(zhuǎn)染的DC與自體淋巴細胞混合培養(yǎng)5天后，收集三組細胞采用Elispot方法檢測淋巴細胞IFN-γ的分泌情況。 7．CTL試驗：以pJW4303/HBc-DC、pJW4303-DC、DC三組細胞為刺激細胞，活化自體淋巴細胞使其成為效應(yīng)細胞，以HepG2.2.15為靶細胞，檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷能力。 結(jié)論：應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體能有效的將HBcAg基因轉(zhuǎn)染到人P