TritonX-100促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、 目的：探討TritonX-100促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用及TritonX-100對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性的影響。方法：1、Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的原代取材和傳代培養(yǎng)。2、用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 大腸桿菌的方法擴(kuò)增構(gòu)建好的質(zhì)粒pegfp-BMP2-N1,pegfp-VEGF165-N1。3、通過(guò)噻唑藍(lán)MTT法,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)得492 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值,確定TritonX-

2、100用于促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最佳濃度。4、在Triton X-100適宜濃度下,脂質(zhì)體介導(dǎo)BMP2與VEGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分7組,細(xì)胞空白組、BMP2 常規(guī)轉(zhuǎn)染組、VEGF 常規(guī)轉(zhuǎn)染組、BMP2 實(shí)驗(yàn)組、VEGF實(shí)驗(yàn)組、BMP2無(wú)脂質(zhì)體組、VEGF無(wú)脂質(zhì)體組。細(xì)胞空白組為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,只含無(wú)血清培養(yǎng)基；BMP2 與 VEGF 常規(guī)轉(zhuǎn)染組,按Lipofect2000使用說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染；VEGF與BMP2實(shí)驗(yàn)組

3、,在脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到培養(yǎng)孔中混勻后,加入適宜濃度的X-100 混勻,其余步驟同常規(guī)轉(zhuǎn)染組；BMP2 與 VEGF 無(wú)脂質(zhì)體組,不加脂質(zhì)體Lipofect2000,只加入適宜濃度的Triton X-100和無(wú)血清培養(yǎng)基。5、在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,用倒置熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中熒光蛋白的表達(dá)情況。6、轉(zhuǎn)染72h后,做實(shí)時(shí)熒光定量PCR,主要檢測(cè)各組中BMP2和VEGF165在轉(zhuǎn)染72h后表達(dá)水平的相對(duì)差異。本試驗(yàn)采用相對(duì)定量 2-△△C

4、t法來(lái)檢驗(yàn)基因的表達(dá)變化。7、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)。采用t檢驗(yàn)比較單變量?jī)山M資料,單因素方差分析比較多組資料,非參數(shù)檢驗(yàn)比較方差不齊者,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),以 P<0 . 05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSSl2.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。結(jié)果：1、Triton X-100用于促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最佳濃度為 0.005%,經(jīng) MTT 法測(cè)得的 OD 值為0.145,與空白細(xì)胞OD值0.151相比,P<0.05,無(wú)統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明在這個(gè)濃度下,Triton X-100 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。2、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染48h后,在置熒光顯微鏡下觀察到BMP2、VEGF常規(guī)轉(zhuǎn)染組和BMP2、VEGF實(shí)驗(yàn)組有熒光表達(dá),而細(xì)胞空白組和BMP2、VEGF無(wú)脂質(zhì)體組無(wú)熒光蛋白的表達(dá),肉眼觀察下,常規(guī)轉(zhuǎn)染組與實(shí)驗(yàn)組的熒光表達(dá)的數(shù)量有差別。3、BMP2、VEGF常規(guī)轉(zhuǎn)染組和BMP2、VEGF實(shí)驗(yàn)組于轉(zhuǎn)染后第3天,實(shí)驗(yàn)組BMP2的相對(duì)表達(dá)量5.94,常規(guī)轉(zhuǎn)染組為4.99,其轉(zhuǎn)染效

6、率提高了19%；實(shí)驗(yàn)組VEGF的相對(duì)表達(dá)量3.48,常規(guī)轉(zhuǎn)染組為 2.77,其轉(zhuǎn)染效率提高了 25.6%。實(shí)驗(yàn)組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組的 BMP2與VEGF表達(dá)水平有差異,P<0.05。結(jié)論：1、Triton X-100可以促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,提高其19%-25.6%的轉(zhuǎn)染效率。2、Triton X-100用于促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最適濃度為0.005%,在這個(gè)濃度下,Triton X-100 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。3、