氮酮促進脂質體介導質粒DNA轉染兔角膜內皮細胞的實驗研究.pdf

1、目的: 研究水溶性氮酮對體外培養(yǎng)的兔眼角膜內皮細胞活性及超微結構的影響，探索水溶性氮酮的眼部安全應用濃度；觀察陽離子脂質體Lipofectamine TM 2000是否能介導目的基因轉移至兔角膜內皮細胞，優(yōu)化陽離子脂質體轉染CECS的條件；探討氮酮（AZONE）促進脂質體介導質粒DNA轉染兔角膜內皮細胞的作用，觀察氮酮對于脂質體轉染的影響，探索提高脂質體轉染效率的方法。
　　 方法: 體外培養(yǎng)兔眼角膜內皮細胞，采用MTT法、掃描

2、和透射電子顯微鏡研究不同濃度水溶性氮酮對細胞活性和超微結構的影響；采用細胞培養(yǎng)方法，以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，通過體外細胞轉染實驗，用不同的細胞融合度、脂質體濃度、脂質體與質粒的比例、轉染時間優(yōu)化轉染條件，熒光顯微鏡觀察目的基因的表達；配制不同轉染試劑，脂質體聯(lián)合pEGFP-N1、氮酮聯(lián)合脂質體及pEGFP-N1、氮酮聯(lián)合pEGFP-N1、單純pEGFP-N1、單純脂質體、單純氮酮，分別處理兔角膜內皮細胞，流式細胞儀及熒光顯微

3、鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達，計算并比較轉染效率。
　　 結果: 濃度0.1g.L-1以下的水溶性氮酮作用24h對角膜內皮細胞的活性沒有明顯影響，濃度0.5g.L-1以上的水溶性氮酮作用24h，可以引起角膜內皮細胞活性下降(P<0.01）。在濃度0.1 g.L-1以下水溶性氮酮作用10min，掃描電子顯微鏡可以觀察到角膜內皮細胞膜的裂隙形成，而對細胞器等結構無明顯損害，濃度0.5 g.L-1及以上的水溶性氮酮可導致細胞器腫脹甚

4、至細胞死亡；角膜內皮細胞內可見脂質體介導的綠色熒光蛋白表達，Lipofectamine TM 在細胞融合度為80%～90%，脂質體/DNA 為3μl/μg，脂質體的量為1.8μl，轉染時間為5 h時，轉染效率最高；脂質體轉染CECS 前以0.1g.L-1 氮酮孵育5min，轉染效率最高，單純氮酮、單純脂質體及對照組處理的細胞不表達綠色熒光蛋白，氮酮聯(lián)合脂質體及pEGFP-N1對兔角膜內皮細胞的轉染效率為42.6%；脂質體聯(lián)合pEGFP2

5、N1組的轉染效率為21.4%；氮酮聯(lián)合pEGFP-N1組的轉染效率為7.2%。單純質粒組的轉染效率為1%，氮酮加脂質體加PEGFP-N1組轉染效率高于其他轉染組(P<0.01)。
　　 結論: 水溶性氮酮在濃度0.1g.L-1可以使角膜內皮細胞膜產(chǎn)生裂隙，而不會導致細胞活性的降低；陽離子脂質體可有效介導目的基因轉移至角膜內皮細胞內，GFP可作為報告基因優(yōu)化脂質體轉染條件。氮酮可促進脂質體介導質粒DNA轉染兔角膜內皮細胞，在有效的