2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的::了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥情況,耐藥基因型別的分布,指導(dǎo)臨床合理用藥。了解新酶的生化特性,等電點(diǎn)和酶對抗菌藥物的水解特性。了解產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌Ⅰ類整合子的流行情況,以及Ⅰ類整合子中基因盒的種類。
   方法:安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心收集35所醫(yī)院2007年隨機(jī)月份住院和門診患者的各種臨床送檢標(biāo)本,無重復(fù)分離的E.coli共355株。全部菌株均由Microscan WalkAw

2、ay-40全自動微生物分析儀(美國DADE公司)自動鑒定系統(tǒng)鑒定。355株大腸埃希菌通過頭孢西丁三維實(shí)驗(yàn)篩選出確證高產(chǎn)AmpC酶菌株,以三維試驗(yàn)陽性菌株總DNA為模板,使用blaampC通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以篩選出攜帶ampC基因菌株;將三維試驗(yàn)陽性菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn),行全編碼引物PCR擴(kuò)增。并用瓊脂平板稀釋法測定其對13種抗菌藥物的耐藥性。對多次測序并經(jīng)GenBank比對后確定的產(chǎn)新酶菌株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):PCR擴(kuò)增臨床分離株和/或轉(zhuǎn)移

3、接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段,PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-18T載體,表達(dá)于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中,再次測定核苷酸序列,結(jié)果至GenBank比對,進(jìn)行DNA序列分析。將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398,轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中,用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法測定臨床分離株和接合子,轉(zhuǎn)化株的MIC。采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取,進(jìn)行酶促反應(yīng)動力學(xué)

4、研究,以初步了解新酶的動力學(xué)特性。等電聚焦電泳測定其等電點(diǎn)(pI)。Southern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解新酶是否為質(zhì)粒介導(dǎo)。PCR篩選Ⅰ類整合酶基因,進(jìn)一步檢測陽性樣本可變區(qū)基因盒序列。檢測攜帶新型AmpC型酶菌株的整合子基因盒。
   結(jié)果:355株大腸埃希菌中21株大腸埃希菌三維實(shí)驗(yàn)陽性,占所有臨床分離菌株的5.9%(21/355),19株經(jīng)PCR檢測攜帶ampC基因,16株轉(zhuǎn)移接合成功,經(jīng)序列分析表明,9株CIT陽性結(jié)

5、果,6株DHA陽性結(jié)果,3株EBC陽性結(jié)果;1株同時(shí)攜帶EBC及DHA。檢出一株EBC型新基因 (序列號為FJ237369);藥敏結(jié)果顯示臨床分離菌株及接合子對多種抗菌藥物耐藥,對頭孢吡肟,亞胺培南,美羅培南敏感。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)和克隆表達(dá)試驗(yàn)均取得成功,其野生株及轉(zhuǎn)化株的MIC結(jié)果顯示:野生株和轉(zhuǎn)化株有著幾乎相同的耐藥譜,但轉(zhuǎn)化株對抗菌藥物的耐藥性有所下降。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的等電聚焦顯示,其

6、等電點(diǎn)在8.6左右,Southern blot實(shí)驗(yàn)提示新酶為質(zhì)粒介導(dǎo)。酶促反應(yīng)動力學(xué)研究,初步了解新酶對5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值,結(jié)果顯示:該酶對頭孢西丁的水解效率最高。產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的大腸埃希菌中16株攜帶有I類整合子,14株擴(kuò)增出了可變區(qū),經(jīng)測序基因盒為編碼磺胺類抗菌藥物耐藥的基因dhfrA17和編碼氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因aadA5,aadA1,aadB。ampC基因不在Ⅰ類整合子基因盒上。
   結(jié)

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