志賀菌屬細(xì)菌整合子與多重耐藥性研究.pdf

1、志賀菌屬(Shigella)是感染性腹瀉的重要病原,它引起的細(xì)菌性痢疾(菌痢)發(fā)病率在我國(guó)居傳染病發(fā)病率的前三位,是我國(guó)傳染病防治工作的重點(diǎn)?？股貞?yīng)用于臨床治療菌痢歷史已久,不僅可以減輕病情、縮短病程,還能減少病人排菌,避免進(jìn)一步傳播。然而隨著抗生素的廣泛使用,臨床頻繁出現(xiàn)耐藥志賀菌屬菌株,而且呈現(xiàn)為多重耐藥(multi-drug resistance,MDR)。多重耐藥志賀菌引起的感染不僅在發(fā)展中國(guó)家,在發(fā)達(dá)國(guó)家也成為影響臨床治療的

2、關(guān)鍵因素。多重耐藥志賀菌屬不僅給細(xì)菌性痢疾的防治帶來(lái)新的挑戰(zhàn),對(duì)細(xì)菌耐藥性的傳播也產(chǎn)生重要影響。因此,志賀菌屬細(xì)菌的多重耐藥問(wèn)題和耐藥機(jī)制引起了人們的廣泛關(guān)注。
　　 志賀菌屬獲得某種抗生素抗性主要通過(guò)兩種機(jī)制,一是細(xì)菌自身染色體基因發(fā)生突變,如抗生素靶位點(diǎn)的突變、調(diào)控基因突變引起膜蛋白表達(dá)的異常或主動(dòng)流出泵系統(tǒng)的激活等,使細(xì)菌對(duì)抗生素從敏感變成抗性;另一機(jī)制則是細(xì)菌從外部獲得耐藥基因,即耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,這是目前人們認(rèn)為臨床

3、多重耐藥株產(chǎn)生的主要原因。許多可移動(dòng)基因單元如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等,攜帶抗生素耐藥基因,使得耐藥基因在細(xì)菌屬、種、株間傳播,加快了耐藥菌株的形成。近年發(fā)現(xiàn)整合子系統(tǒng)參與耐藥基因的傳播。整合子包括整合酶、基因盒和特異性重組位點(diǎn),整合酶可以不斷地從周?chē)h(huán)境捕獲耐藥基因盒或從整合子上切除基因盒。整合子作為一種遺傳元件,它自己不能自由移動(dòng),但它可以位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或者染色體上,通過(guò)其他可移動(dòng)元件,整合子促進(jìn)了耐藥基因的擴(kuò)散,自身的廣泛分布與腸道菌多重

4、耐藥性的形成有關(guān)。研究表明,含有整合子的細(xì)菌菌株比不含有整合子的菌株更多的顯示出對(duì)不同抗生素的耐藥性,整合子一基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥性有關(guān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)志賀菌屬整合子的研究發(fā)現(xiàn)多重耐藥志賀菌攜帶2類整合子多見(jiàn),而1類整合子檢出率相對(duì)較低。對(duì)于耐藥基因盒類型而言,在志賀菌屬中發(fā)現(xiàn)的類型相對(duì)較單一。不論整合子的類型還是攜帶耐藥基因盒的種類,都與志賀菌屬菌株的多重耐藥表型沒(méi)有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此,探索整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥的

5、關(guān)系、評(píng)價(jià)其在志賀菌屬細(xì)菌多重耐藥機(jī)制中的作用和地位是十分必要的。
　　 本研究對(duì)臨床分離的83株福氏志賀菌和7株宋內(nèi)志賀菌進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)定,比較不同類型整合子及耐藥基因盒在志賀菌屬的分布、構(gòu)成差異,并對(duì)典型整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)進(jìn)行克隆和功能分析,以期了解整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥性之間的關(guān)系、正確評(píng)價(jià)整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)在志賀菌屬多重耐藥機(jī)制中的作用和地位。
　　 方法:
　　 1、藥敏實(shí)

6、驗(yàn)
　　 用紙片擴(kuò)散法(disc diffusion test)測(cè)定所有菌株對(duì)以下抗生素藥敏紙片的抑菌環(huán):氨芐青霉素(AMP)、四環(huán)素(TET)、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(SXT)、氯霉素(CHL)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)和頭孢唑林(CFZ)。采用瓊脂稀釋法測(cè)定以下抗生素的最低抑菌濃度(MIC):TET、AMP、CHL、CIP、鏈霉素(STR)、甲氧芐啶(TMP)和磺胺異噁唑(SSS)。
　　

7、 2、PCR方法檢測(cè)整合子的整合酶基因PCR-RFLP分析整合子的可變區(qū)基因
　　 分別針對(duì)1、2、3類整合子的整合酶基因設(shè)計(jì)引物,煮沸法提取菌株總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)整合酶基因。用試劑盒分別提取菌株的基因組DNA和質(zhì)粒DNA,分別用針對(duì)典型1類整合子的可變區(qū)引物hep58-hep59、針對(duì)非典型1類整合子的可變區(qū)引物hep58-ISVR、針對(duì)2類整合子的可變區(qū)引物hep74-hep51,進(jìn)行整合子的可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增檢

8、測(cè)。選用合適的限制性內(nèi)切酶,對(duì)得到相同長(zhǎng)度大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP(restrictive fragment lengthpolimorphism)分析,得到相同內(nèi)切酶圖譜的片段被認(rèn)為是序列相同的片段。
　　 3、Southern雜交
　　 按Roche公司地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Dig DNA Labeling and Dection)的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先將整合酶基因intI1和intI2的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回

9、收純化后定量,用隨機(jī)引物法獲得地高辛標(biāo)記探針。將提取的細(xì)菌基因組DNA分用BamHI、PstI雙酶切,將酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。用毛細(xì)管虹吸法將瓊脂糖凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜,120℃烤箱干烤0.5h,將DNA固定于尼龍膜。經(jīng)過(guò)預(yù)雜交、探針雜交、洗膜、避光顯色等步驟,照相記錄結(jié)果。
　　 4、質(zhì)粒接合傳遞實(shí)驗(yàn)
　　 以E.coli DH5a空菌為受體,以90株志賀菌為供體分別進(jìn)行。分別挑取純

10、化的供體菌、受體菌單個(gè)菌落用LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,10倍稀釋入2ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基,連續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)1-3 h使得OD600值約為0.6左右。吸取供體菌、受體菌各100μl于1ml的新鮮LB液體培養(yǎng)基中,于37℃靜止培養(yǎng)16-18h,劃線接種于麥康凱固體培養(yǎng)基平板,37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-18h。觀察菌落形態(tài),在無(wú)色半透明菌落中夾雜的紅色菌落即為接合子,挑取單一的紅色菌落接種LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。再

11、次劃線接種麥康凱固體培養(yǎng)基平板,37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-18h后觀察形態(tài)以再次確認(rèn)。提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行瓊脂糖水平凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)獲得確認(rèn)的接合子進(jìn)行紙片法藥敏試驗(yàn)。
　　 5、整合子-耐藥盒基因的序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)生分析
　　 針對(duì)典型1類整合子整合酶和可變區(qū)整個(gè)區(qū)域、非典型1類整合子的可變區(qū)區(qū)域、2類整合子整合酶和可變區(qū)整個(gè)區(qū)域分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物測(cè)序后采用Blastn軟件檢索Genbank數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行序

12、列的同源性比較和分析。從所有識(shí)別度在99％-100％的序列中,選取來(lái)自不同菌綱、菌目和菌屬的多個(gè)序列,用ClustalX軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行多重序列比較,用MEGA4.1軟件作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。構(gòu)建方法分別選擇基于距離的鄰近法(NJ)和最大簡(jiǎn)約法(MP)。兩種方法均選擇了Bootstrap法進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的驗(yàn)證分析。
　　 6、整合子-耐藥盒基因的克隆及克隆子的功能分析
　　 選擇典型菌株,用PCR方法分別擴(kuò)增位于可接合傳遞質(zhì)

13、粒上的典型1類整合子耐藥基因盒基因pv1、位于基因組DNA上的2類整合子耐藥基因盒基因pv2和整個(gè)2類整合子基因intI2pv2,分別將它們與克隆載體puc18連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取質(zhì)粒酶切并進(jìn)行特異PCR鑒定陽(yáng)性克隆子。分別檢測(cè)陽(yáng)性克隆puc-pv1和puc-pv2對(duì)抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。分別用陽(yáng)性克隆puc-intI2pv2和DH5a空菌作為受體菌,與供體菌志賀菌05100進(jìn)行質(zhì)粒接合傳遞實(shí)驗(yàn),比較耐藥性傳遞情況

14、。
　　 7、多重耐藥志賀菌的無(wú)抗生素壓力連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)
　　 對(duì)耐藥譜不同的、攜帶整合子不同的10株福氏志賀菌,進(jìn)行無(wú)抗生素的多次傳代培養(yǎng)。將所選菌株挑單個(gè)菌落經(jīng)LB肉湯過(guò)夜增菌后,1:100倍LB肉湯稀釋,繼續(xù)37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h,至OD600值約為0.08-0.12之間后,繼續(xù)1:100倍LB肉湯稀釋37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h后,再次繼續(xù)1:100倍LB肉湯稀釋37℃,200rpm振蕩過(guò)夜培

15、養(yǎng)。如此1日3次,連續(xù)培養(yǎng)10日。在此期間,每隔5次傳代就進(jìn)行菌株的分離,并進(jìn)行MIC的藥敏實(shí)驗(yàn)和整合子的PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1、志賀菌屬耐藥性和整合子分布的檢測(cè)
　　 90株志賀菌(83株福氏志賀菌,7株宋內(nèi)志賀菌)對(duì)TET、NAL、AMP、SXT和CHL的耐藥率較高,分別為93.3％、92.2％、91.1％、82.2％和75.6％;多重耐藥率達(dá)95.6％(86/90),最常見(jiàn)的耐藥譜為AMP-T

16、ET-SXT-CHL-NAL(31/90,34.4％)。整合酶基因陽(yáng)性率為87.8％(79/90),其中intI1單獨(dú)陽(yáng)性率3.3％；intI2單獨(dú)陽(yáng)性率10％;intI1和intI2同時(shí)陽(yáng)性率為74.4％,3類整合子整合酶基因未檢出。多重耐藥菌的整合酶陽(yáng)性率89.5％(77/86)。intI2陽(yáng)性率在多重耐藥株和非多重耐藥株中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、志賀菌屬中整合子-耐藥基因盒的特征分析
　　 共發(fā)現(xiàn)4種整合

17、子耐藥基因盒,序列提交Genbank獲得登錄號(hào)分別為FJ895301、FJ895302、GQ214137和EF634237。56株多重耐藥志賀菌同時(shí)攜帶3種整合子-耐藥基因盒系統(tǒng):位于可接合傳遞質(zhì)粒上的典型1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5或dfrA12-orfF-adA2、位于染色體DNA上的非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-aadA1和位于染色體DNA上的2類整合子耐藥基因盒dfrA1-sat1-aadA1。

18、　　 非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1在對(duì)AMP-TET-CHL聯(lián)合耐藥菌中的陽(yáng)性率高于非聯(lián)合耐藥菌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、志賀菌屬整合子-耐藥基因盒的序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)生分析
　　 序列分析和系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn),除整合酶基因intI1和非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1外,1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5、afrA12-orf-aadA2以及2類整合子整合

19、酶intl2基因、耐藥基因盒dfrA1-sat1-aadA1都存在基因分化現(xiàn)象。
　　 4、志賀菌屬整合子-耐藥基因盒的克隆及克隆子功能分析
　　 1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5陽(yáng)性克隆使DH5a對(duì)STR的MIC從0.5μg/ml提高至4μg/ml,對(duì)TMP的MIC從2μg/ml提高至64μg/ml。2類整合子耐藥基因盒dfrA1-sat1-aadA1陽(yáng)性克隆使DH5a對(duì)STR的MIC從0.5μg/ml提高

20、至32μg/ml,對(duì)TMP的MIC從2μg/ml提高至64μg/ml。
　　 通過(guò)質(zhì)粒接合傳遞實(shí)驗(yàn),來(lái)自志賀菌05100含有1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5的質(zhì)粒未對(duì)受體菌DH5a的抗生素敏感性產(chǎn)生影響,而來(lái)自志賀菌06208含有1類整合子耐藥基因盒dfrA12-orf-aadA2的質(zhì)粒使得受體菌DH5a獲得對(duì)SXT和AMP的耐藥性。對(duì)于相同供體菌福氏志賀菌05100而言,含有2類整合子克隆的大腸桿菌,與大腸桿菌空菌

21、一樣,經(jīng)質(zhì)粒接合傳遞后,多種抗生素的MIC并無(wú)變化。
　　 5、多重耐藥志賀菌的無(wú)抗生素壓力連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)
　　 無(wú)抗生素壓力的連續(xù)30次傳代實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):志賀菌05015、05105、06208分別丟失了對(duì)CHL、SXT和CIP的單一耐藥性,其整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)無(wú)變化;志賀菌06218丟失了原有的全部耐藥性(TXT、SXT和AMP),同時(shí)其僅有的位于基因組上的2類整合子-耐藥基因盒系統(tǒng),即intI2基因以及耐藥基因盒df

22、rA1-sat1-aadA1,也發(fā)生了丟失。
　　 結(jié)論：
　　 1.志賀菌屬細(xì)菌對(duì)常用抗生素普遍耐藥,多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重(95.6％)。intI2基因陽(yáng)性與志賀菌屬多重耐藥有關(guān);非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1陽(yáng)性與志賀菌屬AMP-TET-CHL聯(lián)合耐藥有關(guān)。
　　 2.首次報(bào)道多重耐藥志賀菌可同時(shí)攜帶3種不同整合子-耐藥基因盒:位于可接合傳遞質(zhì)粒上的典型1類整合子、位于染色體上的非典型1

23、類整合子和2類整合子。
　　 3.來(lái)自不同菌屬的整合酶基因和耐藥基因盒在系統(tǒng)發(fā)生方面存在不同程度的分化。
　　 4.志賀菌屬整合子攜帶的耐藥基因盒僅針對(duì)特定抗生素產(chǎn)生特異性耐藥,不同耐藥基因盒致耐藥程度不一。
　　 5.志賀菌屬含整合子的質(zhì)?？山雍蟼鬟f與整合子無(wú)關(guān)的其他抗生素耐藥性。
　　 6.志賀菌屬2類整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)可能通過(guò)參與其他基因元件的移動(dòng)和活動(dòng),來(lái)參與多個(gè)耐藥基因結(jié)構(gòu)的聚集或切除,從而