耐多藥大腸埃希菌產(chǎn)AmpC酶基因型研究及耐藥性分析.pdf

1、目的:探討瀘州地區(qū)耐多藥大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)產(chǎn)質(zhì)粒AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶)現(xiàn)狀及其基因型分布,分析產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌對常用抗生素的耐藥特點,為臨床合理應(yīng)用抗生素和防止耐藥基因的廣泛傳播提供理論依據(jù)。
　　方法:1.初篩試驗:根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)(Clinical labora-tory Standards Insitute, CLSI)推薦的紙片擴散法(kerby-Baue

2、r紙片擴散法)檢測71株大腸埃希菌對頭孢西丁的耐藥性,即抑菌環(huán)≤18mm為可疑產(chǎn)AmpC酶陽性菌株。2.三維試驗:根據(jù)Coudron等推薦的頭孢西丁三維試驗方法,通過大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶提取物能否水解頭孢西丁(FOX)來判定其是否產(chǎn) AmpC酶,從而檢測出產(chǎn)AmpC酶菌株。3.紙片擴散法(Kerby-Bauer法,K-B法):測定本地臨床分離71株大腸埃希菌對頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢西丁(FOX)、氨曲南(ATM

3、)、亞胺培南(IPM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、鏈霉素(S)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)共10種抗菌藥物的耐藥性并篩選出產(chǎn) AmpC酶菌株菌株。4.PCR技術(shù):檢測三維實驗陽性菌株的AmpC酶基因。參考文獻(xiàn)設(shè)計6對特異性引物,采用普通質(zhì)粒小提試劑盒提取大腸埃希菌質(zhì)粒DNA用于PCR反應(yīng)模板。各標(biāo)本分別使用六對設(shè)計好的引物擴增,陽性擴增片段長度分別為520bp、462bp、405bp、346bp、302bp、

4、190bp。擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外線檢測儀觀察結(jié)果。5.基因測序:分別取質(zhì)粒 AmpC酶基因擴增陽性的菌株的PCR擴增產(chǎn)物用核酸定量儀測得 DNA濃度>300ug/ml,并送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行基因測序。
　　結(jié)果:1.頭孢西丁三維試驗:在71株大腸埃希菌中粗篩陽性產(chǎn)AmpC酶菌株共11株,通過頭孢西丁三維試驗分離出產(chǎn)AmpC酶的菌株8株,占總菌株數(shù)11.27％。2.藥敏結(jié)果:(1)71株大腸埃希菌藥敏結(jié)果顯示對亞

5、胺培南全敏感,阿米卡星,頭孢西丁,氨曲南,頭孢吡肟,敏感率較高均大于59.15％,較低的是頭孢噻肟,鏈霉素,慶大霉素,環(huán)丙沙星,左氧氟沙星。(2)以耐多藥菌株24株(33.80％)和雙耐菌株35株為主(33.80％),其中耐多藥模式的表型以GEN+CTX+LEV(16株,22.54％)為主。3.三維實驗陽性菌株(產(chǎn)AmpC酶菌株)對多種常用抗生素的耐藥率明顯高于非產(chǎn)AmpC酶菌株(χ2檢驗,P<0.05)。4.PCR檢測AmpC酶基因情

6、況:對三維實驗陽性的8株菌株行PCR擴增,2株呈陽性,測序結(jié)果顯示2株均為DHA-1型。
　　結(jié)論:1.瀘州地區(qū)臨床分離的大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs情況較嚴(yán)重,產(chǎn)AmpC酶的情況相對較少,并都呈現(xiàn)出多重耐藥的現(xiàn)象。2.本地區(qū)的大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶的基因型以DHA-1為主,且產(chǎn)AmpC酶菌株的耐藥率明顯高于非產(chǎn)AmpC酶菌株。3.本地區(qū)大腸埃希菌檢測出2株疑似為SSBLs,其基因型組合均為DHA-1型AmpC酶和CTX-M型