耐多藥大腸埃希菌質粒介導的耐藥基因探討.pdf

1、目的：探討瀘州地區(qū)質粒介導的產ESBLs(extended–sperectrumβ-lactmases)耐多藥大腸埃希菌TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3,CTX-M-22、CTX-M-24等6種耐藥酶基因分布狀況和對常見抗生素的耐藥情況,為臨床治療大腸埃希菌感染合理選用抗菌藥物提供理論依據。
　　方法：1.紙片擴散法(Kerby-Bauer法,K-B法):采用美國全國臨床檢驗標準委員會(the National Comm

2、ittee For Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推薦的該方法測定71株大腸埃希菌對常見的氨基糖苷類,氟喹諾酮類,第三代頭孢菌素類抗生素的耐藥性。該實驗方法要點:將接種于M-H(酪蛋白瓊脂)平板上(37℃孵育24小時)的待測細菌制備成與0.5麥氏標準管濁度相同的菌液,并把菌液均勻涂布于滅菌的Mueller-Hinton培養(yǎng)基表面,數分鐘干燥后,用無菌鑷將藥敏紙片分別平貼于M-H培養(yǎng)基表面,每張紙

3、片間距離不少于25mm,紙片中心距離平皿邊緣不少于15mm。將貼有紙片的平皿于37℃孵育24小時后,用毫米尺測量抑菌環(huán)直徑,抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限,抑菌環(huán)直徑的大小反映了測試細菌對測定抗生素的敏感程度。大腸埃希菌菌標準菌株ATCC25922進行質控對照。2.PCR技術:采用質粒小提試劑盒制備質粒DNA擴增模板;2×TaqPCRMasterMix,6種靶基因PCR擴增體系均為:每一個PCR反應體系共35ul,其中模板7u

4、l,引物1對各5ul,2×TaqPCRMasterMix15ul,ddH2O8ul。PCR反應循環(huán)參數為:94℃預變性3min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30個循環(huán);循環(huán)結束后72℃再延伸5min。PCR產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳,以標準菌株ATCC25922進行陰性對照。用紫外線檢測儀分析結果并用凝膠成像儀攝像;3.PCR產物測序:PCR產物進行基因測序儀檢測堿基序列,與已知的6種基因序列相比較。

5、　　結果：1.藥敏實驗結果:臨床分離的71株大腸埃希菌中,全敏6株(8.57%);單耐16株(22.86%);雙耐19株(27.14%);耐多藥30株(42.86%)。2.耐多藥單酶基因檢測結果:TEM有11株(36.67%);SHV僅1株(3.33%),所占比例較低;CTX-M有23株(76.67%);CTX-M-3有21株(70%),CTX-M-22有錯誤!未找到引用源。9株(12.86%);CTX-M-24有錯誤!未找到引用源。2

6、4株(80%)。3.耐多藥多酶基因檢測結果:含2種酶基因同時檢出的有30株(其中CTX-M+CTX-M-3有12株(40%);CTX-M-24+CTX-M有12株(40%);CTX-M-22+CTX-M-24有6株(20%),含3種耐藥酶基因共檢出13株(32.5%),含5種耐藥酶基因有1株(3.33%),未發(fā)現(xiàn)上述6種耐藥性質粒酶基因3株(10.00%)。CTX-M類基因(包括CTX-M,CTX-M-3,CTX-M-22,CTX-M-

7、24)和SHV,TEM類基因的檢出具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。攜CTX-M-24,CTX-M-3,TEM,CTX-M,CTX-M-24+CTX-M基因的菌株對AMK和TM的療效具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);攜帶TEM,CTX-M,CTX-M-3基因的菌株對CFX和CPZ的療效具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：瀘州地區(qū)耐多藥大腸埃希菌存在質粒介導的TEM、SHV、CTX-M、CTX-M-3、CTX-M-22、CTX