吸煙對重型顱腦損傷伴發(fā)肺損傷的影響及穿心蓮內酯在吸煙誘發(fā)肺損傷中的保護機制研究.pdf

1、第一部分:吸煙對重型顱腦損傷伴發(fā)急性肺損傷的影響
　　 目的:
　　 探討吸煙對重型顱腦損傷伴發(fā)急性肺損傷的影響。
　　 方法:
　　 選擇162例我院于2010年1月至2011年12月收治的重型顱腦損傷患者，其中男性139例，女性23例，年齡18～72歲，平均年齡(44.86±13.51)歲。其中交通事故傷85例，高空墜落傷30例，跌倒傷28例，暴力傷8例，其他11例。根據是否吸煙分為吸煙組（74例）和

2、非吸煙組（88例）。
　　 于入院后第5天依據急性肺損傷診斷標準判斷重型顱腦損傷患者是否患有急性肺損傷，比較吸煙組與非吸煙組急性肺損傷發(fā)病率。于入院后第0、5天檢測重型顱腦損傷患者肺功能。肺容量指標:呼吸頻率(Breathingfrequency,BF)、肺活量(Vitalcapacity,VC);肺通氣量指標:用力呼氣一秒量(Forcedexpiratoryvolumeinthefirstsecond，FEV1)、用力呼氣肺活

3、量(Forcedexpiratoryvitalcapacity，FVC)、最大分鐘通氣量(Mostminuteventilation，MMV);小氣道指標:最高呼氣流速(Peakexpiratoryflow,PEF)。于入院后第0、5天采集肺泡灌洗液，按照試劑盒說明書檢測肺泡灌洗液上清液中的腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-8(interleukin-8，IL-8)和丙二醛(Ma

4、londialdehydeMDA)水平及超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活性。
　　 結果:
　　 1.吸煙組中有26例重型顱腦損傷患者伴發(fā)急性肺損傷，發(fā)病率達到35.14％，而非吸煙組中僅有16例伴發(fā)急性肺損傷，發(fā)病率為18.18％，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。
　　 2.入院后第0天，吸煙組的BF、VC、FEV1、FVC、MMV、PEF均低于非吸煙組，其中，兩組的

5、MMV、PEF的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。入院后第5天與入院后第0天比較，兩組患者的肺功能均呈下降趨勢，吸煙組的下降趨勢較非吸煙組更為明顯。
　　 3.入院后第0天，吸煙組的TNF-α、IL-8、MDA水平均高于非吸煙組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);吸煙組的SOD活性低于非吸煙組。入院后第5天與入院后第0天比較，兩組患者的TNF-α、IL-8、MDA水平均呈上升趨勢，吸煙組的上升趨勢較非吸煙組更為明顯;兩組患者

6、的SOD活性呈下降趨勢，吸煙組的下降趨勢較非吸煙組更為明顯。入院后第5天，兩組的4個指標具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 與非吸煙組相比較，吸煙組的重型顱腦損傷患者的基礎肺功能和SOD活性較低，TNF-α、IL-8和MDA水平較高;傷后肺功能和SOD活性降低以及TNF-α、IL-8和MDA水平升高更為明顯，急性肺損傷發(fā)病率更高，可能與吸煙和顱腦損傷協同促進炎癥反應和氧化應激相關。
　　 第二部

7、分:穿心蓮內酯在被動吸煙誘發(fā)肺損傷中的保護作用
　　 目的:
　　 本部分研究穿心蓮內酯對吸煙誘導的小鼠肺部急性炎癥反應的作用。
　　 方法:
　　 本研究所用實驗動物為32只清潔級成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡），體重為18-20g。將實驗小鼠隨機分為4組（每組8只），分別為:正常對照組(C)、煙草煙霧暴露組(CS)、用溶質DMSO處理的煙草煙霧暴露組(CS+DMSO)和穿心蓮內酯處理的煙草煙霧

8、暴露組(CS+A)。穿心蓮內酯是在煙草煙霧暴露前1h通過腹腔內注射途徑給予，劑量為1mg/kg體重。將模型組小鼠置于被動吸煙箱中，每天被動吸煙9支，連續(xù)4天。對照組小鼠置于相同的實驗條件下只是不接受被動吸煙處理。小鼠于實驗第5天經腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，并作肺部組織學分析。對BALF中細胞進行計數，并經Wright-Giemsa染色進行細胞分類記

9、數。ELSIA法分析BALF中腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，巨噬細胞炎癥蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2，MIP-2)，白介素10(interleukin-10，IL-10)，LPS誘導CXC趨化因子(LPS-inducedCXCchemokine，LIX)，干擾素γ(interferon-γ

10、，IFN-γ)的水平。并對肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性進行測定。體外研究中，肺上皮細胞A549細胞作為細胞模型。用DNA片段化法分析穿心蓮內酯對煙草煙霧誘導的A549細胞凋亡的影響，并用Westernblot法分析穿心蓮內酯對煙草煙霧介導的凋亡相關蛋白的表達的影響。
　　 結果:
　　 HE染色顯示，被動吸煙組小鼠肺部毛細血管充血，肺泡出血;肺泡壁稍增厚;肺泡腔內充滿大量單核/巨噬細胞

11、，多形核白細胞等炎癥細胞，以及大量滲出液。DMSO處理對吸煙誘導的肺部急性炎癥反應沒有明顯影響。而穿心蓮內酯處理組小鼠肺泡炎癥輕，肺泡腔中炎癥細胞及滲出液較少。穿心蓮內酯能夠抑制吸煙誘導的肺部炎癥反應還表現為:穿心蓮內酯能夠顯著抑制吸煙誘導的小鼠BALF中總細胞，單核/巨噬細胞，中性粒細胞以及淋巴細胞的數目的增加，減少吸煙介導的小鼠BALF中腫瘤壞死因子-α，白介素-6和巨噬細胞炎癥蛋白-2的分泌，以及降低吸煙誘發(fā)的肺部髓過氧化物酶的活

12、性。體外結果顯示，煙草煙霧處理能夠促進A549細胞的凋亡，而穿心蓮內酯能夠顯著抑制煙草煙霧誘導的A549細胞的凋亡。
　　 結論:
　　 穿心蓮內酯能夠抑制吸煙誘導的小鼠肺部的急性損傷;能夠保護煙霧煙草介導的肺上皮細胞A549細胞的凋亡。
　　 第三部分:穿心蓮內酯在被動吸煙誘發(fā)肺損傷中作用機制
　　 目的:
　　 深入揭示穿心蓮內酯影響吸煙誘導肺損傷的相關分子機制，重點探討血紅素加氧酶-1(He

13、meoxygenase-1，HO-1)通路對該藥物發(fā)揮保護作用的貢獻。
　　 方法:
　　 在體外研究中肺上皮細胞A549細胞作為細胞模型。利用RT-PCR和Westernblot法研究煙草煙霧和穿心蓮內酯對A549細胞中HO-1mRNA和蛋白表達的影響。本研究所用實驗動物為32只清潔級成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡），體重為18-20g。將實驗小鼠隨機分為4組（每組8只），分別為:正常對照組(C)、煙霧暴露組(

14、CS)、穿心蓮內酯處理組(A)和穿心蓮內酯+ZnPP組(A+Z)。穿心蓮內酯是在煙霧暴露前1h通過腹腔內注射途徑給予，劑量為1mg/kg體重。ZnPP為一種很強的HO抑制劑，本文應用其阻斷HO-1通路。ZnPP在穿心蓮內酯注射之前1h通過腹腔注射方式給予，劑量為10μmol/kg體重。對照組小鼠通過腹腔注射給予等量的生理鹽水。將模型組小鼠置于被動吸煙箱中，每天被動吸煙9支，連續(xù)4天。對照組小鼠置于相同的實驗條件下只是不接受被動吸煙處理。

15、小鼠于實驗第5天經腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，并作肺部組織學分析。PCR和Westernblot用來檢測小鼠肺組織中HO-1RNA和蛋白質的表達情況，并對肺組織HO-1酶活性進行測定。對BALF中細胞進行計數，并經Wright-Giemsa染色進行細胞分類記數。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定BALF總蛋白濃度。ELSIA法分析BALF中瘤壞死因子-α

16、(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和巨噬細胞炎癥蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2，MIP-2)的水平。對肺組織和BALF中的MDA水平進行測定。并對BALF中LDH的活性以及肺組織中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GS

17、H-Px)，過氧化氫酶(Catalase，CAT)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性進行測定。Westernblot法檢測穿心蓮內酯對信號傳導及轉錄活化子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)通路活化的影響。
　　 結果:
　　 煙草煙霧處理和穿心蓮內酯預處理顯著增加HO-1mRNA和蛋白表達。而且這種誘導作用呈劑量依賴關系，這

18、提示HO-1在煙草煙霧誘導細胞損傷過程中可能具有保護作用。HE染色顯示，被動吸煙組小鼠肺部毛細血管充血，肺泡出血;肺泡壁稍增厚;肺泡腔內充滿大量單核/巨噬細胞，多形核白細胞等炎癥細胞，以及大量滲出液。DMSO處理對吸煙誘導的肺部急性炎癥反應沒有明顯影響。而穿心蓮內酯處理組小鼠肺泡炎癥輕，肺泡腔中炎癥細胞及滲出液較少，表明穿心蓮內酯能夠抑制吸煙誘導的肺部炎癥反應。而用ZnPP阻斷HO-1通路后，穿心蓮內酯的保護作用被逆轉。這說明穿心蓮內酯

19、對吸煙誘導肺部炎癥的抑制作用依賴于HO-1通路活化。另外，穿心蓮內酯能夠抑制吸煙誘導的肺部炎癥反應還表現為:穿心蓮內酯能夠顯著抑制吸煙誘導的小鼠BALF中總細胞，單核/巨噬細胞，中性粒細胞以及淋巴細胞的數目的增加，減少吸煙介導的的小鼠BALF總蛋白濃度，腫瘤壞死因子-α，白介素-6和巨噬細胞炎癥蛋白-2的分泌，減少吸煙誘導的肺組織和BALF中的MDA水平。以及降低吸煙誘發(fā)肺組織中超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶和髓過氧化物

20、酶的活性和BALF中LDH的活性。而穿心蓮內酯介導的這些保護吸煙誘導肺部炎癥反應的作用均隨著ZnPP抑制HO-1信號通路而被逆轉，提示HO-1在穿心蓮內酯對被動吸煙誘導的肺氧化應激、炎癥及損傷的保護效應中起著重要的作用。穿心蓮內酯處理顯著提高吸煙小鼠肺組織中STAT3磷酸化水平，而對總STAT3蛋白影響不明顯，這表明穿心蓮內酯可促進肺組織STAT3通路活化。穿心蓮內酯對STAT3通路的活化作用能夠被ZnPP抑制，這提示STAT3可能位于