miR-199a通過靶向調控DDR1的表達抑制小鼠乳腺癌細胞4T-1的轉移.pdf

1、乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤類型，緊隨肺癌之后，嚴重威脅女性健康。其發(fā)病機制十分復雜，但根本原因在于遺傳基因的改變，其中包括癌基因的過度活化和抑癌基因功能的抑制。乳腺癌的發(fā)生、生長、侵襲與轉移等發(fā)展階段都存在相應的遺傳基因改變，都受到基因的調節(jié)。乳腺癌的主要致死原因在于其向腦部、肺部、肝臟及骨骼等部位的遠處轉移，因此研究乳腺癌的轉移機制對乳腺癌治療具有重要意義。當今，乳腺癌的臨床治療方法主要有：手術療法、化學藥物療法、內分泌療法以及生物分子靶向

2、療法。雖然化學藥物治療在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率，但是藥物抵抗的頻繁出現(xiàn)使得腫瘤治療困難重重。因此，生物分子靶向治療應運而生，開啟了乳腺癌治療的新篇章。探索乳腺癌發(fā)生、生長、侵襲與轉移等發(fā)展階段的分子機制，尋找新的生物分子治療靶點成為研究乳腺癌的重中之重。
　　miR-199家族包括miR-199-a1，miR-199-a2和miR-199b三個成員。miR-199a有兩個成熟序列：miR-199a-5p和miR-199

3、a-3p，分別位于人的19號染色體（miR-199-a1）和1號染色體（miR-199-a2）上。研究表明miR-199a在腫瘤細胞中存在過量表達或者表達量下調現(xiàn)象，提示miR-199a可以通過調控下游癌基因或者抑癌基因參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　DDR（discoidin domain receptor）家族包括2個成員：DDR1和DDR2，DDR2只有一個亞型，DDR1則分為5個亞型（DDR1a-DDR1e）。DDR1a

4、、DDR1b和DDR1c是具有活性的DDR1亞型，其中DDR1c是最長的DDR1亞型。DDR1d和DDR1e沒有激酶活性。DDR1在人和小鼠的很多組織中表達，尤其是腦部、肺部、腎臟和脾臟。研究表明DDR1通過調節(jié)腫瘤細胞與膠原的相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。DDR1在很多類型的腫瘤細胞中表達量上調，如：乳腺癌、肺癌、腦癌、肝癌、淋巴瘤等。這一表達的失調和功能的改變與腫瘤的發(fā)展過程和腫瘤病人的預后不良密切相關。
　　在本研究

5、中，我們證實了miR-199a和DDR1在乳腺癌轉移過程中的作用并驗證了miR-199a通過靶向調控基因DDR1的表達發(fā)揮其生物學作用。
　　實驗一過表達miR-199a抑制小鼠乳腺癌細胞4T-1的轉移
　　目的：觀察miR-199a在乳腺癌轉移過程中發(fā)揮的作用。
　　方法：構建miR-199a的表達質粒pcDNA3.1-miR-199a，利用重組質粒建立穩(wěn)定過表達miR-199a的4T-1-Luc小鼠乳腺癌細胞系，并

6、通過QRT-PCR檢測技術進行驗證。在體外，運用 TranswellTM實驗研究穩(wěn)定細胞系的遷移能力，分析 miR-199a對乳腺癌細胞遷移的作用；在體內，將穩(wěn)定細胞系通過尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內，利用熒光素酶活體成像實驗觀察miR-199a對乳腺癌細胞體內轉移的作用，通過小鼠肺組織的H&E（hematoxylin and eosin）染色和免疫組化實驗做進一步驗證。
　　結果：過表達 miR-199a的小鼠乳

7、腺癌穩(wěn)定細胞系構建成功；在體外，過表達miR-199a抑制乳腺癌細胞的遷移；在體內，過表達miR-199a抑制乳腺癌的肺轉移。
　　結論：miR-199a抑制小鼠乳腺癌的轉移。
　　實驗二 miR-199a對DDR1的調控關系研究
　　目的：證實DDR1是miR-199a的下游靶向調控基因。
　　方法：利用生物信息學網站分別預測人和鼠的miR-199a對 DDR1非翻譯區(qū)（3’UTR）的可能結合位點；克隆野生型D

8、DR13’UTR序列以及每一個可能的結合位點突變后的突變型DDR13’UTR序列；利用熒光素酶報告基因實驗驗證miR-199a對DDR1的直接調控作用和靶向調控位點。
　　結果：miR-199a可以靶向下調野生型DDR1的表達；確定了miR-199a調控DDR1的靶向結合位點。
　　結論：DDR1是miR-199a的下游靶基因。
　　實驗三 DDR1在乳腺癌轉移過程中的生物學作用
　　目的：研究干涉DDR1的表達

9、對乳腺癌轉移的作用。
　　方法：構建 DDR1的干涉質粒 shDDR1，并且包裝重組慢病毒。利用重組慢病毒建立干涉 DDR1表達的4T-1-Luc小鼠乳腺癌穩(wěn)定細胞系，并通過 QRT-PCR和Western Blot技術驗證細胞系內DDR1的干涉情況。在體外，通過TranswellTM實驗研究穩(wěn)定細胞系的遷移能力，分析 DDR1對乳腺癌細胞遷移的作用；在體內，將穩(wěn)定細胞系經尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內，利用熒光素酶

10、活體成像實驗分析DDR1對乳腺癌細胞體內轉移的作用，通過小鼠肺組織的H&E染色和免疫組化實驗做進一步驗證。
　　結果：干涉DDR1表達的小鼠乳腺癌穩(wěn)定細胞系構建成功；在體外，干涉DDR1的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移；在體內，干涉 DDR1的表達能夠抑制乳腺癌的肺轉移。
　　結論：干涉DDR1的表達能夠抑制小鼠乳腺癌的轉移。
　　實驗四 miR-199的臨床意義研究
　　目的：研究miR-199與乳腺癌臨床預后的