UCH-L3對(duì)乳腺癌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)影響及對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、研究背景：
　　HIF-1α是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧微環(huán)境時(shí)表達(dá)的一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄激活因子。HIF-1α與 HIF-1β結(jié)合形成低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1），HIF-1可對(duì)多種基因進(jìn)行靶向調(diào)控，介導(dǎo)腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性。細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平取決于其蛋白在泛素化-蛋白酶體途徑中的降解。泛素化-蛋白酶體途徑包括泛素化和蛋白酶體降解兩個(gè)過程。泛素化是泛素分子在一系列泛素酶的作用下經(jīng)過活化、結(jié)合、再與底物蛋白連接形成多聚泛素底物

2、蛋白復(fù)合物的過程。蛋白酶體降解是通過蛋白酶體途徑降解底物蛋白的過程。HIF-1α的泛素化在調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)及激活為H IF-1起著重要作用。去泛素化是泛素化的可逆過程，是泛素化的底物蛋白復(fù)合物在去泛素化酶（DUBs）的作用下解離泛素分子，使泛素分子循環(huán)利用從而平衡細(xì)胞內(nèi)蛋白水平。UCH-L3是一種去泛素化酶，參與底物蛋白的去泛素化過程，從而對(duì)細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化發(fā)揮一定的作用。
　　目的：
　　本研究探討乳腺癌細(xì)胞中UC

3、H-L3對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響及對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期、凋亡等生長(zhǎng)分子機(jī)制的影響。
　　方法：
　　采用siRNA干擾技術(shù)沉默MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系UCH-L3基因；采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將UCH-L3慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系，獲得UCH-L3低表達(dá)和高表達(dá)細(xì)胞系。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)隨機(jī)干擾組和UCH-L3 siRNA實(shí)驗(yàn)干擾組以及正常組、陰性對(duì)照組、UC

4、H-L3慢病毒過表達(dá)組之間HIF-1α、UCH-L3的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平變化，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè) MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化。
　　結(jié)果：
　　與隨機(jī)干擾組相比，UCH-L3 siRNA實(shí)驗(yàn)干擾組的UCH-L3 mRNA水平和蛋白水平明顯下降，同時(shí)HIF-1α蛋白水平的增加；為進(jìn)一步明確UCH-L3對(duì)HIF-1α影響機(jī)制，施加放線菌酮（CHX）抑制蛋白合成0-36小時(shí)，發(fā)現(xiàn)UCH-L3 siR

5、NA干擾組的HIF-1α蛋白水平隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)沒有降低，提示UCH-L3不影響HIF-1α蛋白合成。在UCH-L3過表達(dá)組、陰性對(duì)照組、正常組之間得出UCH-L3過表達(dá)組的UCH-L3 mRNA水平和蛋白水平明顯升高，同時(shí)HIF-1α蛋白水平的下降；施加蛋白酶體抑制劑MG132抑制蛋白降解0-36h，發(fā)現(xiàn)UCH-L3過表達(dá)組的HIF-1α蛋白水平隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢(shì)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)隨機(jī)組和實(shí)驗(yàn)干擾組細(xì)胞周期沒有