通過DNAshuffling方法靶向乳腺癌細(xì)乳腺癌細(xì)胞的腺相關(guān)病毒.pdf

1、在傳統(tǒng)的治療手段漸漸不能滿足治療疾病的今天,基因治療則成為一個(gè)新的治療癌癥的選擇,同時(shí)尋找一個(gè)理想的基因治療載體也成為了目前基因治療研究中不可或缺的一個(gè)重要方向。
　　 AAV病毒作為攜帶基因治療的載體,1)具有安全性好,沒有明顯致病性,2)不能自主復(fù)制,3)宿主范圍廣,4)可長期表達(dá)外源基因,并且5)特異性的整合到人19號(hào)染色體上等優(yōu)點(diǎn)而成為目前基因載體研究中的重要的基因攜帶載體,同時(shí)也是基因治療眾多基因治療載體中最具潛力載體

2、之一。
　　 但也正是由于其宿主范圍廣,也導(dǎo)致了其對(duì)組織或細(xì)胞沒有特異性,導(dǎo)致AAV介導(dǎo)的基因治療對(duì)靶細(xì)胞的感染效率低。因此提高AAV病毒感染目的細(xì)胞的效率和AAV病毒轉(zhuǎn)運(yùn)組織的靶向性,是改造AAV病毒的關(guān)鍵。越來越多的研究文獻(xiàn)表明目前改造AAV病毒靶向性主要通過以下幾種方法:1)單純的化學(xué)修飾,2)外殼基因插入刪除改造,3),交換不同血清型AAV之間的營救標(biāo)記區(qū)域以及4)產(chǎn)生嵌合型基因載體等1。其中通過實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生嵌合型的基因載體

3、定向進(jìn)化成為靶向某一組織或者某一細(xì)胞的新型AAV是目前改造AAV病毒趨向性的手段之一。
　　 本文就是采用DNA shuffling的方法,將九種不同來源的親本型AAV病毒AAV1-AAV9通過PCR方法擴(kuò)增出衣殼基因cap片段,通過DNaseI酶隨機(jī)酶切,瓊脂糖電泳后割膠回收100-300bp大小片段,試驗(yàn)了兩種不同的shuffling PCR方法,結(jié)果顯示用隨機(jī)酶切產(chǎn)物直接作為PCR模板的方案特異性條帶不明顯,而使用用無引物

4、PCR和有引物PCR結(jié)合的方法則能較好的擴(kuò)增出2300bp左右的特異性條帶,將PCR產(chǎn)物回收酶切以后連接到筆者自己構(gòu)建的帶有致死基因CCDB的病毒包裝載體pARC上,產(chǎn)生一系列不同親本型來源的嵌合型AAV基因的質(zhì)粒pAdL,以此構(gòu)建AAV隨機(jī)的衣殼基因文庫。
　　 在此基礎(chǔ)上,利用對(duì)AAV文庫基因包裝病毒,建立嵌合型AAV病毒文庫,利用文庫病毒在體外對(duì)AAV病毒進(jìn)行定向進(jìn)化,篩選獲得一種能夠靶向乳腺癌細(xì)胞的病毒。經(jīng)過重復(fù)三輪感染

5、以后發(fā)現(xiàn)一種能夠靶向乳腺癌細(xì)胞sk-br-3的新型AAV病毒,通過基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)這種新型的嵌合型AAV病毒AAV-Y與AAV1,AAV2,AAV7,AAV8具有同源性。
　　 在進(jìn)一步研究該病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染能力的實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn),用相同濃度的AAV-Y病毒感染肝癌細(xì)胞BEL-7721,則幾乎沒有感染能力,而對(duì)乳腺癌細(xì)胞sk-br-3具有一定的感染能力,為以后進(jìn)一步研究AAV-Y病毒的功能打下了基礎(chǔ)。同時(shí)也證明了本研究中所設(shè)計(jì)的