通過DNAshuffling方法靶向乳腺癌細乳腺癌細胞的腺相關(guān)病毒.pdf

1、在傳統(tǒng)的治療手段漸漸不能滿足治療疾病的今天,基因治療則成為一個新的治療癌癥的選擇,同時尋找一個理想的基因治療載體也成為了目前基因治療研究中不可或缺的一個重要方向。
　　 AAV病毒作為攜帶基因治療的載體,1)具有安全性好,沒有明顯致病性,2)不能自主復(fù)制,3)宿主范圍廣,4)可長期表達外源基因,并且5)特異性的整合到人19號染色體上等優(yōu)點而成為目前基因載體研究中的重要的基因攜帶載體,同時也是基因治療眾多基因治療載體中最具潛力載體

2、之一。
　　 但也正是由于其宿主范圍廣,也導(dǎo)致了其對組織或細胞沒有特異性,導(dǎo)致AAV介導(dǎo)的基因治療對靶細胞的感染效率低。因此提高AAV病毒感染目的細胞的效率和AAV病毒轉(zhuǎn)運組織的靶向性,是改造AAV病毒的關(guān)鍵。越來越多的研究文獻表明目前改造AAV病毒靶向性主要通過以下幾種方法:1)單純的化學(xué)修飾,2)外殼基因插入刪除改造,3),交換不同血清型AAV之間的營救標(biāo)記區(qū)域以及4)產(chǎn)生嵌合型基因載體等1。其中通過實驗產(chǎn)生嵌合型的基因載體

3、定向進化成為靶向某一組織或者某一細胞的新型AAV是目前改造AAV病毒趨向性的手段之一。
　　 本文就是采用DNA shuffling的方法,將九種不同來源的親本型AAV病毒AAV1-AAV9通過PCR方法擴增出衣殼基因cap片段,通過DNaseI酶隨機酶切,瓊脂糖電泳后割膠回收100-300bp大小片段,試驗了兩種不同的shuffling PCR方法,結(jié)果顯示用隨機酶切產(chǎn)物直接作為PCR模板的方案特異性條帶不明顯,而使用用無引物

4、PCR和有引物PCR結(jié)合的方法則能較好的擴增出2300bp左右的特異性條帶,將PCR產(chǎn)物回收酶切以后連接到筆者自己構(gòu)建的帶有致死基因CCDB的病毒包裝載體pARC上,產(chǎn)生一系列不同親本型來源的嵌合型AAV基因的質(zhì)粒pAdL,以此構(gòu)建AAV隨機的衣殼基因文庫。
　　 在此基礎(chǔ)上,利用對AAV文庫基因包裝病毒,建立嵌合型AAV病毒文庫,利用文庫病毒在體外對AAV病毒進行定向進化,篩選獲得一種能夠靶向乳腺癌細胞的病毒。經(jīng)過重復(fù)三輪感染

5、以后發(fā)現(xiàn)一種能夠靶向乳腺癌細胞sk-br-3的新型AAV病毒,通過基因比對發(fā)現(xiàn)這種新型的嵌合型AAV病毒AAV-Y與AAV1,AAV2,AAV7,AAV8具有同源性。
　　 在進一步研究該病毒對腫瘤細胞的感染能力的實驗中我們還發(fā)現(xiàn),用相同濃度的AAV-Y病毒感染肝癌細胞BEL-7721,則幾乎沒有感染能力,而對乳腺癌細胞sk-br-3具有一定的感染能力,為以后進一步研究AAV-Y病毒的功能打下了基礎(chǔ)。同時也證明了本研究中所設(shè)計的