鈉氫交換體1在內(nèi)毒素性急性肺損傷中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 鈉氫交換體1在大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷中的表達(dá)
　　 目的：建立大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写笫蠓谓M織上鈉氫交換體1的表達(dá)變化情況及其與炎癥的關(guān)系。
　　 方法：40只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機(jī)分成空白對(duì)照組（C組）、脂多糖2h組（L-2h組）、脂多糖4h組（L-4h組）和脂多糖6h組（L-6h組），每組各10只。C組大鼠給予股靜脈輸注生理鹽水；L-2h組、L-4h組和

2、L-6h組大鼠均給予股靜脈輸注6mg/kg 脂多糖。實(shí)驗(yàn)開始后2 h 頸動(dòng)脈放血處死C組和L-2h組大鼠, 4小時(shí)和6小時(shí)后分別處死L-4h組和L-6h組大鼠。監(jiān)測(cè)各組大鼠基本生命體征；光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理改變；計(jì)算急性肺損傷評(píng)分和肺組織濕/干重比值；檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白的濃度；測(cè)定肺組織髓過氧化物酶活性；EMSA檢測(cè)肺組織細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-Κb的活性；免疫組化、RT-PCR和West

3、ern Blot檢測(cè)肺組織鈉氫交換體1Mrna和蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：（1）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠平均動(dòng)脈壓明顯下降（均P＜0.05）、心率和呼吸頻率明顯上升（均P＜0.05）；脂多糖4h組和6h組大鼠動(dòng)脈血氧分壓顯著下降（均P＜0.05），（2）空白對(duì)照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔無滲出物；脂多糖各組大鼠肺組織病理改變明顯，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)有血性滲出液。和空白對(duì)照組比較，

4、脂多糖各組大鼠肺組織急性肺損傷評(píng)分均明顯增高（P＜0.05）。（3）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織濕/干重比均明顯上升（P＜0.05）；支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白的濃度均明顯增高（均P＜0.05）。（4）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織髓過氧化物酶活性均明顯增高（P＜0.05）。（5）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-Κb的活性均明顯增高（P＜0.05）。（6）和空白對(duì)照組

5、比較，免疫組化檢測(cè)脂多糖各組大鼠肺組織NHE1的表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05）。（7）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05）。（8）和空白對(duì)照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1的蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：以6mg/kg的劑量給予大鼠靜脈注射脂多糖后4h就產(chǎn)生了明顯的急性肺損傷，表現(xiàn)為大鼠基本生命體征的內(nèi)毒素休克癥狀出現(xiàn)；大鼠大體標(biāo)本組織

6、學(xué)炎癥病理改變；肺組織含水量增加；肺組織及支氣管肺泡灌洗液中相關(guān)炎性因子增加；與此同時(shí)，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1Mrna和蛋白的表達(dá)水平也隨著急性肺損傷炎癥反應(yīng)的加重而明顯增加。
　　 第二部分 阿米洛利對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護(hù)作用
　　 目的：探討阿米洛利預(yù)先給藥對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。
　　 方法：40只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機(jī)分成空

7、白對(duì)照組（C組）、脂多糖組（L組）、阿米洛利組(A組)和阿米洛利預(yù)給藥組(AL組)。C組靜脈輸注生理鹽水3ml；L組依次靜脈輸注1ml生理鹽水及2ml脂多糖；A組依次靜脈輸注1ml阿米洛利及2ml生理鹽水；AL組先輸注1ml阿米洛利再輸注2ml脂多糖。靜脈注射脂多糖/阿米洛利6小時(shí)后頸動(dòng)脈放血處死大鼠。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理改變；計(jì)算急性肺損傷評(píng)分和肺組織濕/干重比值；測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中總蛋白的濃度；檢測(cè)肺組織髓過氧化物酶活

8、性、丙二醛濃度和超氧化物歧化酶活力；半定量免疫組化法檢測(cè)肺組織過氧亞硝酸鹽硝基酪氨酸殘基的含量；RT-PCR檢測(cè)肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)鈉氫交換體1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及p38絲裂原活化蛋白激酶的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：大鼠靜脈注射脂多糖產(chǎn)生急性肺損傷的同時(shí)伴隨有肺組織鈉氫交換體1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及 p38絲裂原活化蛋白激酶的顯著激活；鈉氫交換體1抑制劑阿米洛利預(yù)先給藥對(duì)大鼠內(nèi)

9、毒素性急性肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的激活有關(guān)。
　　 第三部分絲裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利防治大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用
　　 目的：探討絲裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利預(yù)先給藥防治脂多糖誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及可能機(jī)制。
　　 方法：70只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機(jī)均分成空白對(duì)照組（C組）、脂多糖組（L組）、阿米洛利預(yù)給藥組(AL組)、

10、PD098059預(yù)給藥組(PL組)、SB203580預(yù)給藥組(SL組)、 阿米洛利聯(lián)合PD098059預(yù)給藥組(APL組)和阿米洛利聯(lián)合SB203580預(yù)給藥組(ASL組)。 C組靜脈輸注生理鹽水3ml；L組靜脈輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總?cè)莘e共3ml；AL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總?cè)莘e共3ml；PL組先靜脈輸注PD098059(0.3mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)

11、及生理鹽水總?cè)莘e共3ml；SL組先靜脈輸注SB203580(10mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總?cè)莘e共3ml；APL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注PD098059(0.3mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)總?cè)莘e共3ml；ASL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注SB203580(10mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)總?cè)莘e共3ml。實(shí)驗(yàn)開始6小時(shí)后頸動(dòng)脈放血處死大鼠。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組

12、織病理改變；計(jì)算急性肺損傷評(píng)分和肺組織濕/干重比值；測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白的濃度；檢測(cè)肺組織髓過氧化物酶活性；RT-PCR檢測(cè)肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達(dá)水平; Western blot法檢測(cè)鈉氫交換體1的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：鈉氫交換體1抑制劑阿米洛利預(yù)先給藥對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷有保護(hù)作用；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的阻滯劑可以完全取消阿米洛利的作用，說明阿米洛利防治大鼠內(nèi)毒素性

13、急性肺損傷的作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的激活有關(guān)。
　　 第四部分 鈉氫交換體1在脂多糖活化鼠源性巨噬細(xì)胞中的表達(dá)變化及阿米洛利的作用
　　 目的：觀察鈉氫交換體1Mrna和蛋白在脂多糖活化鼠源性巨噬細(xì)胞中的表達(dá)變化及阿米洛利預(yù)先給藥對(duì)它的影響。
　　 方法：傳代培養(yǎng)的鼠源性巨噬細(xì)胞株（RAW264.7細(xì)胞）以1×106個(gè)／ml的密度接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后, 隨機(jī)分為4組：僅加RPMI 1640培

14、養(yǎng)液的對(duì)照組;加300μM阿米洛利的阿米洛利組; 加1μg/ml 脂多糖的脂多糖組; 加300μM阿米洛利干預(yù)30min后再加1μg/ml 脂多糖的阿米洛利預(yù)給藥組; 實(shí)驗(yàn)開始24 h后, ELISA法和Griess法分別檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α濃度和一氧化氮的水平、應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)活性氧敏感性熒光探針DCFH-DA檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平; 實(shí)驗(yàn)開始3h后, 采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)鈉氫交換體