HIF-1α在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由于創(chuàng)傷、燒傷或敗血癥等因素引起的以急性、進(jìn)行性非心源性呼吸衰竭為特征的疾病，是臨床上常見的難治性危重癥，具有較高的死亡率。盡管醫(yī)務(wù)工作者做了大量的相關(guān)工作，但到目前為止，尚缺乏治療ALI特異有效的方法。
　　脂多糖（lipopolysacchari

2、de，LPS）是ALI的常見致病因素之一。許多研究證明，LPS能結(jié)合于單核/巨噬細(xì)胞表面的CD14受體，并促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)。近年來，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-induciblefactor1α，HIF-1α）被認(rèn)為在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。文獻(xiàn)表明，LPS能誘導(dǎo)多種細(xì)胞表達(dá)HIF-1α，尤其是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。與缺氧和其他刺激不同的是，LPS通過增加HIF-1α的mRNA水平，促進(jìn)

3、蛋白翻譯，并抑制其降解來誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的增加。研究進(jìn)一步表明，HIF-1α在髓樣細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥與LPS通過TOLL樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）誘導(dǎo)的敗血癥中起了非常重要的作用。同時，HIF-1α也參與了皮膚和關(guān)節(jié)中巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。因此，限制巨噬細(xì)胞內(nèi)HIF-1α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能有益于減輕炎癥相關(guān)的組織損傷。
　　丹參酮IIA（tanshinone IIA，T

4、IIA）是唇形科植物丹參中的脂溶性活性成分之一，大量文獻(xiàn)報道TIIA具有抑制炎性介質(zhì)與氧自由基釋放的作用。我們以前的實(shí)驗(yàn)表明TIIA能顯著降低LPS導(dǎo)致的小鼠的死亡率，并能減輕在體和離體實(shí)驗(yàn)中LPS導(dǎo)致的肺損傷。但是，目前尚不清楚TIIA是如何減輕LPS性肺損傷的。本實(shí)驗(yàn)擬觀察TIIA對內(nèi)毒素血癥時炎癥反應(yīng)的影響，研究TIIA對LPS性肺損傷的保護(hù)作用是否與HIF-1α有關(guān)，并進(jìn)一步探索TIIA是如何調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。
　　

5、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　?。?）觀察TIIA對內(nèi)毒素性肺損傷時炎癥反應(yīng)的作用；
　?。?）研究LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的作用；
　?。?）研究TIIA對LPS誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)的抑制作用；
　?。?）探索TIIA抑制LPS誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　動物實(shí)驗(yàn)
　　雄性BALB/c小鼠（18-22g）適應(yīng)環(huán)境后，腹腔注射LPS建立小鼠肺損傷模型，隨機(jī)分為四組：1）

6、生理鹽水（NS）對照組（n=8），給小鼠注射兩次NS，時間間隔為0.5小時；2）TIIA對照組（n=8），先給小鼠注射TIIA，0.5小時后注射生理鹽水；3）LPS組（n=8），先給小鼠注射NS，0.5小時后注射LPS；4）TIIA/LPS組（n=8）,先給小鼠注射TIIA，0.5小時后注射LPS。在各組，腹腔注射NS、TIIA（10mg/kg）和LPS（10mg/kg）。在第二次注射后6小時取肺進(jìn)行病理觀察，或進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液（b

7、ronchoalveolar lavage fluid，BALF）灌洗，觀察BALF中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）的含量、總細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的數(shù)目，檢測血清與BALF中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素（inter leukin，IL）-1β、IL-6的含量，以及Western blotting檢測小鼠肺組織中HIF-1α的含量。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

8、
　　為了觀察LPS對HIF-1α表達(dá)的誘導(dǎo)作用，指數(shù)生長期的NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞被血清饑餓16-20小時后，用不同濃度的LPS（0.5-10μg/ml）刺激0-8小時，或用LPS（1μg/ml）刺激6小時，Westernblotting檢測HIF-1α的表達(dá)。
　　為了研究TIIA對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子釋放、HIF-1α表達(dá)的作用及其相關(guān)機(jī)制，指數(shù)生長期的NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞被血清饑餓1

9、6-20小時后，用0-20μg/ml的TIIA預(yù)處理細(xì)胞0.5小時后，LPS（1μg/ml）刺激6-12小時，取細(xì)胞上清測定炎癥因子的含量，或收集細(xì)胞提蛋白進(jìn)行Westernblotting檢測相關(guān)蛋白的變化。
　　為了觀察HIF-1α在炎癥反應(yīng)中的作用，將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染于RAW264.7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞被LPS（1μg/ml）刺激12小時，觀察細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β與IL-6的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

10、
　?。?）TIIA預(yù)處理改善LPS導(dǎo)致的肺損傷
　　腹腔注射LPS明顯增加BALF中的LDH的含量（P<0.01），說明LPS導(dǎo)致了小鼠急性肺損傷。但是，TIIA預(yù)處理顯著地抑制了LDH含量的增加（P<0.05），即TIIA能夠減輕LPS導(dǎo)致的肺損傷。
　　形態(tài)學(xué)觀察表明LPS組中肺組織明顯充血、水腫并有大量炎性細(xì)胞的浸潤，而在TIIA/LPS組內(nèi)毒素所致的肺損傷明顯減輕，肺組織結(jié)構(gòu)趨于正常。
　?。?）TII

11、A預(yù)處理減輕LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)
　　LPS能夠顯著增加BALF中總細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的數(shù)目（P<0.01），但TIIA預(yù)處理顯著地抑制了上述指標(biāo)的增加（P<0.05），說明TIIA能夠減輕LPS導(dǎo)致的炎性細(xì)胞浸潤。
　　在正常小鼠的血清與BALF中，TNF-α、IL-1β與IL-6的含量極低；但這些炎癥因子在LPS組明顯增加（P<0.01）。在TIIA/LPS組，上述炎癥因子的含量較LPS組明顯降低（P<0.05）。

12、　　同時，在RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中，TNFα、IL-1β與IL-6的含量在LPS組均較對照組明顯升高（P<0.05；P<0.01），但TIIA預(yù)處理濃度依賴性地降低了這些炎癥因子的含量（P<0.05；P<0.01）。
　?。?）HIF-1α在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用
　　LPS（0.5-10μg/ml）刺激NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞6小時后，HIF-1α的表達(dá)增加，并且這種誘導(dǎo)作用是LPS濃度依賴性

13、的。用LPS（1μg/ml）刺激兩種巨噬細(xì)胞0-8小時，HIF-1α的表達(dá)在LPS刺激2小時后增加，在6-8小時達(dá)高峰。
　　將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染于RAW264.7細(xì)胞，可顯著降低LPS刺激RAW264.7細(xì)胞時TNF-α、IL-1β與IL-6的分泌量（P<0.05），提示HIF-1α參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　?。?）TIIA抑制LPS誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)
　　同對炎癥因子的抑制效果相似，在NR838

14、3與RAW264.7巨噬細(xì)胞中，不同濃度TIIA預(yù)處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)的增加。同時，TIIA（10mg/kg）也顯著地抑制了內(nèi)毒素性小鼠肺組織中HIF-1α的表達(dá)。
　?。?）TIIA預(yù)處理對LPS刺激時HIF-1αmRNA的表達(dá)沒有作用
　　Real-timePCR結(jié)果表明，LPS明顯增加NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞中HIF-1α的mRNA水平（P<0.05）

15、，但是TIIA預(yù)處理（10μg/ml）對LPS導(dǎo)致的HIF-1α的mRNA水平?jīng)]有明顯作用。
　　（6）TIIA預(yù)處理抑制LPS刺激時HIF-1α的蛋白翻譯
　　Westernblotting結(jié)果表明，在NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞中，LPS明顯活化了AKT與MAPK通路，但是TIIA預(yù)處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)上述通路的活化。
　　同時，LPS導(dǎo)致了p70S6K1、S6核糖體蛋白、4E-

16、BP1和eIF4E的磷酸化，但是TIIA預(yù)處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性的逆轉(zhuǎn)上述蛋白的活化。
　?。?）TIIA預(yù)處理通過蛋白酶體途徑促進(jìn)LPS刺激時HIF-1α的蛋白降解
　　Westernblotting結(jié)果表明，在CHX存在的情況下，在LPS刺激的NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞中，HIF-1α的半衰期分別為8.5分鐘與9分鐘。TIIA預(yù)處理（10μg/ml）后，HIF-1α的半衰期分別降到了4.9分

17、鐘與5分鐘。
　　TIIA預(yù)處理（10μg/ml）明顯地抑制LPS刺激時NR8383與RAW264.7巨噬細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)。但是在蛋白酶體MG132存在的情況下，TIIA的這種抑制作用被取消了。
　　結(jié)論：
　　（1）TIIA能抑制內(nèi)毒素性肺損傷時的炎癥反應(yīng)并能改善小鼠ALI。
　?。?）TIIA改善LPS性肺損傷的作用與其抑制HIF-1α的表達(dá)有關(guān)。
　?。?）TIIA對LPS誘導(dǎo)的HIF-1αm