一株拮抗鏈霉菌的篩選及活性物質(zhì)鑒定.pdf

1、放線菌是一類有巨大應(yīng)用價(jià)值的微生物類群，其次級(jí)代謝產(chǎn)物是開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥防治植物真菌病害的主要來(lái)源之一，因此篩選具有拮抗作用放線菌是生物農(nóng)藥研究與開(kāi)發(fā)的首要步驟。
　　首先，本實(shí)驗(yàn)從中國(guó)多個(gè)省份的農(nóng)田、森林、濕地、溫泉、河床等不同的生態(tài)環(huán)境采集的土樣，最終分離獲得320株放線菌。黃瓜枯萎病是一類真菌性土傳病害，其病原菌為半知菌亞門(mén)鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.cucumerinum）

2、。以黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.cucumerinum）為靶標(biāo)指示菌從中篩選得到了77株拮抗菌株，其中菌株M527不僅對(duì)F.oxysporum f.sp.cucumerinum的拮抗活性最強(qiáng)，而且對(duì)多株植物病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。通過(guò)生長(zhǎng)特性和生理生化特性分析，結(jié)合16S rRNA同源序列分析，對(duì)該菌株的菌屬進(jìn)行鑒定，確定為Streptomyces rimosus M527。S.rimosus M527的發(fā)酵液稀

3、釋8倍后，仍能完全抑制F.oxysporum f.sp.cucumerinum的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)；根據(jù)溫室黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn)，S.rimosus M527的發(fā)酵液不僅促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)而且對(duì)黃瓜枯萎病有很好的抑制效果，使黃瓜植株的病情指數(shù)由71.1下降到20.0，治療效果為72.1％。
　　其次以F.oxysporum f.sp.cucumerinum作為活性跟蹤指示菌，通過(guò)有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、DiaionHP-20凝膠柱層析、制備型

4、HPLC對(duì)活性化合物進(jìn)行分離純化，結(jié)合MS、1H-NMR和13C-NMR波譜數(shù)據(jù)對(duì)活性化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。從S.rimosus M527的發(fā)酵液中分離得到活性化合物—龜裂殺菌素，并對(duì)該化合物的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化：色譜柱為ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）；檢測(cè)器為2998PDA光電二極管檢測(cè)器；流動(dòng)相A為甲醇B為水（0.1%乙酸），梯度洗脫的程序如下：0～15min，5%～70%A；15～25min70%A

5、；25～35min70%～100%A；35~45min100%~5%A；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為304nm；進(jìn)樣量為5μL，柱溫為室溫，對(duì)該色譜條件進(jìn)行探究，對(duì)該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性、精確度等進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　將粗提龜裂殺菌素稀釋系列濃度（mg/L）：17.56；8.78；4.39；2.20；1.10；0.55；0.27；0.14，濃度為8.78mg/L時(shí)能夠明顯抑制黃瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)；當(dāng)濃度為2.20mg/L時(shí)可完全抑制黃瓜

6、枯萎病菌的孢子萌發(fā)。17.56mg/L的龜裂殺菌素溶液與傳統(tǒng)農(nóng)藥乙蒜素（80%）1000倍稀釋液進(jìn)行黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn)，施藥后14d和21d龜裂殺菌素的抑制效果分別為78.3%和70.6%，農(nóng)藥乙蒜素的抑制效果66.7%和42.7%。
　　最后，為考察S.rimosus M527抗性基因otrA對(duì)模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）M145次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，以S.rimosus M527為研究材料，設(shè)

7、計(jì)引物克隆了抗性基因otrA并將其置于鏈霉菌整合型載體pIB139中的PermE*啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了重組載體pIB139-otrA，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到S.coelicolor M145中獲得重組菌M145-OA。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重組菌M145-OA的產(chǎn)孢速度明顯高于原始菌株，另外將原始菌株M145與重組菌M145-OA進(jìn)行發(fā)酵性能比較，重組菌M145-OA中放線紫紅素產(chǎn)量比原始菌株M145提高近2倍。通過(guò)RT-PCR分析發(fā)