一株弧菌拮抗菌的鑒定、抑菌特性及應(yīng)用效果的初步研究.pdf

1、近年來(lái)，伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，各種養(yǎng)殖生物受到的病害威脅也越來(lái)越嚴(yán)重。病害的發(fā)生不僅帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給環(huán)境帶來(lái)較大的影響。而為防治水產(chǎn)生物病害而濫用抗生素等化學(xué)藥物，則會(huì)對(duì)環(huán)境和人類產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。益生菌作為抗生素的替代品，可以抑制病原菌，為養(yǎng)殖動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)，提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，改善水質(zhì)條件，修復(fù)微生態(tài)環(huán)境，因此益生菌的在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用日漸受到人們的重視。益生菌的作用機(jī)理之一是通過(guò)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)。因此，選擇

2、具有較高抑菌活性的細(xì)菌作為潛在的益生菌進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)具有重要的實(shí)踐意義。
　　本研究對(duì)從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離出一株對(duì)弧菌病原菌具有拮抗作用的菌株進(jìn)行了鑒定、產(chǎn)物性質(zhì)分析和應(yīng)用的初步研究，旨在為將其最終應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。研究獲得的具體結(jié)果如下:
　　1.一株弧菌拮抗菌的分類鑒定及其抑菌作用研究
　　本研究從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘分離篩選出一株對(duì)病原菌有拮抗作用的菌株，編號(hào)為BL1。采用十字交叉法、點(diǎn)種法以及牛津杯法對(duì)其進(jìn)

3、行了體外拮抗試驗(yàn)，以確定其抑菌譜。研究結(jié)果顯示，菌株BL1對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticu)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)及副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)具有明顯拮抗作用。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。采用單因素分析法進(jìn)一步研究了菌株BL1的最佳培養(yǎng)條件，確定其在培養(yǎng)溫度28℃、初始pH7.0、接種量

4、1％(V/V)、轉(zhuǎn)速190rpm/min的條件下生長(zhǎng)狀況最好。
　　2.菌株BL1抑菌產(chǎn)物的初步分離與性質(zhì)分析
　　本研究以優(yōu)化培養(yǎng)條件后的枯草芽孢桿菌BL1（Bacillus subtilis）發(fā)酵液為研究對(duì)象，以刨傷弧菌(Vibrio vulnificus)為指示菌，采用牛津杯法作為檢測(cè)方法，對(duì)菌株BL1發(fā)酵液中起抑菌作用的抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果影響的實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)24h后的菌液抑菌活性最好

5、;采用過(guò)濾、飽和硫酸銨沉淀及超濾等方法對(duì)培養(yǎng)24h的菌株BL1的發(fā)酵液進(jìn)行初步分離純化處理，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌BL1發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)為胞外分泌型、非蛋白類、分子量大于10kDa的物質(zhì);對(duì)經(jīng)過(guò)初步分離純化的抑菌物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性的研究，發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)對(duì)高溫（60-100℃）和pH（3.0-11.0）的耐受能力比較強(qiáng)，對(duì)蛋白酶K不敏感?？梢钥闯?，菌株BL1所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有很好的抑菌作用及穩(wěn)定性，表明該菌株可能具有作為益生菌應(yīng)用于海水養(yǎng)殖的

6、潛力。
　　3.潑灑和投喂拮抗菌BL1對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和水體弧菌數(shù)量的影響
　　本研究對(duì)潛在益生菌BL1進(jìn)行了菌株安全性檢驗(yàn)后，以潑灑和投喂兩種方式將菌株BL1應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖中，以期了解其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及水體中弧菌數(shù)量的影響。兩種方式均設(shè)置3個(gè)不同的濃度梯度，其中，投喂組添加量分別為107、109和1011cfu/kg（以活菌量計(jì)），潑灑組添加量分別為106、108和101

7、0cfu/m3，以投喂基礎(chǔ)飼料組為對(duì)照組，潑灑周期為5天，實(shí)驗(yàn)共持續(xù)42天。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中任選1個(gè)潑灑周期按潑灑后12h以及1、2、3、4和5d定時(shí)采樣測(cè)定水體弧菌數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量對(duì)蝦的生長(zhǎng)情況，餌料利用率及存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)生長(zhǎng)方面，在兩種施用方式下，除了潑灑組106 cfu/m3，其他處理組中菌株BL1均能顯著促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)，提高對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率(SGR)和餌料利用率(FER)。其中，投喂組以109cfu/ m3為最適濃度，