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文檔簡介
1、目的:研究表明,AGEs和RAGE在糖尿病慢性并發(fā)癥中起重要作用,糖尿病并發(fā)癥多表現(xiàn)血管炎癥損傷,因為T淋巴細胞與炎癥反應的啟動和調(diào)節(jié)過程密切相關(guān),推測AGEs可能影響T淋巴細胞的免疫功能。本研究觀察AGEs對Jurkat細胞(CD4+T細胞)表面RAGE表達、炎癥因子分泌及相關(guān)信號通路的影響。這些研究可進一步闡明AGEs和RAGE在血管炎癥免疫損傷中的作用機制,為治療糖尿病慢性并發(fā)癥提供新靶點。
方法:①常規(guī)制備AGEs
2、,MTT法觀察不同濃度AGEs或BSA(0~200μg/ml)對PHA(0.25μg/ml)預刺激的Jurkat細胞生長的影響。②不同濃度AGEs或BSA(0~200μg/ml)作用于PHA(0.25μg/ml)預刺激的Jurkat細胞24h,Western Blot檢測RAGE表達的變化;ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IFN-γ的分泌。同時為觀察RAGE在AGEs誘導的炎癥因子分泌中的作用,用RAGE抗體預先處理Jurkat細胞2
3、4h,再予AGEs干預,設非特異IgG2a為對照。③為研究RAGE介導的胞內(nèi)信號,相同濃度(200μg/ml)AGEs或BSA作用于PHA預刺激后的Jurkat細胞0、15、30、60min,免疫熒光(普通熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡)檢測CaMKIV的核轉(zhuǎn)位;同時觀察anti-RAGE對CaMKIV活化的影響。
結(jié)果:①濃度50~200μg/ml的AGEs作用于PHA預刺激的Jurkat細胞24h后,MTT結(jié)果顯示細胞的
4、生存率無明顯變化(P>0.05)。②不同濃度AGEs或BSA作用于PHA預刺激的Jurkat細胞,Western Blot結(jié)果顯示BSA對RAGE表達無明顯影響,而AGEs可上調(diào)RAGE的表達,與BSA組比較差異有統(tǒng)計學意義(濃度50組P<0.05,濃度100、200組P<0.01)。③200μg/mlAGEs或BSA作用于Jurkat細胞不同時間后,ELISA結(jié)果顯示AGEs可促進其分泌炎癥因子TNF-α及IFN-γ,24h達高峰。不
5、同濃度AGEs作用24h后,可促使Jurkat細胞上調(diào)炎癥因子TNF-α及IFN-γ表達(P<0.01);anti-RAGE預處理細胞后,AGEs誘導的炎癥因子表達減少,與AGEs處理組比較P<0.01。④免疫熒光結(jié)果顯示AGEs處理Jurkat細胞30min后可促進CaMKIV蛋白核轉(zhuǎn)位,而BSA組未觀察到明顯的核轉(zhuǎn)位;anti-RAGE預處理后,AGEs誘導的蛋白核轉(zhuǎn)位減少,熒光減弱。
結(jié)論:AGEs可上調(diào)Jurkat
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