IFN-γ和TNF-α聯(lián)合作用誘導(dǎo)小鼠胰島細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究IFN-γ和TNF-α對(duì)NOD/Ltj小鼠胰島細(xì)胞及胰島瘤細(xì)胞株MIN6凋亡的影響。
　　方法：
　　1.IFN-γ和TNF-α對(duì)NOD/Ltj小鼠胰島細(xì)胞活性的影響：分離NOD/Ltj小鼠胰島細(xì)胞，分別用IFN-γ單獨(dú)或與TNF-α聯(lián)合刺激細(xì)胞，MTT法分析細(xì)胞活力的變化。
　　2.IFN-γ和TNF-α對(duì)NOD/Ltj小鼠胰島瘤細(xì)胞系MIN6活性的影響：貼壁培養(yǎng)MIN6細(xì)胞，分別用IFN-γ、TNF-α和

2、 IFN-γ+TNF-α刺激細(xì)胞，MTT法分析MIN6細(xì)胞活力的變化；倒置顯微鏡下觀察分組刺激后MIN6細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；Hoechst染細(xì)胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察MIN6細(xì)胞核形態(tài)變化；提取MIN6細(xì)胞的DNA，瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA凋亡的片段大小情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α對(duì)MIN6細(xì)胞凋亡的影響。免疫印跡法檢測(cè)早期凋亡的MIN6細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.M

3、TT法分析結(jié)果顯示，刺激48h后，IFN-γ對(duì)NOD/Ltj小鼠胰島細(xì)胞有毒性作用，并且IFN-γ與TNF-α聯(lián)合刺激對(duì)胰島活力有明顯的抑制作用。
　　2.MTT法分析顯示，單獨(dú)IFN-γ或TNF-α對(duì)MIN6細(xì)胞有一定的毒性作用，兩者聯(lián)合對(duì)MIN6細(xì)胞活力的抑制具有協(xié)同作用，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性（P＜0.05）。倒置顯微鏡下觀察到未處理組的細(xì)胞形態(tài)伸展良好，呈瓦片狀。IFN-γ和TNF-α聯(lián)合刺激12h，24h和48h后，細(xì)胞

4、形態(tài)從不規(guī)則的方形瓦片狀變化成圓球狀，最后部分細(xì)胞開(kāi)始漂浮。激光共聚焦顯微鏡下觀察到IFN-γ或TNF-α單獨(dú)作用MIN6細(xì)胞，其細(xì)胞核形態(tài)與對(duì)照組相比差異性不明顯；但是二者同時(shí)作用時(shí)，MIN6細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)濃縮等細(xì)胞凋亡特征。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TNF-α單獨(dú)刺激MIN6細(xì)胞48h后，與對(duì)照組比較，DNA有明顯的凋亡片段；其聯(lián)合刺激時(shí)，凋亡片段更多。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞因子IFN-γ和T

5、NF-α對(duì)MIN6細(xì)胞的毒性具有顯著的協(xié)同作用，并且IFN-γ和TNF-α對(duì)MIN6細(xì)胞的毒性主要是誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞的早期凋亡而不是壞死或者晚期凋亡。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明 IFN-γ和TNF-α降低了MIN6細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.細(xì)胞因子IFN-γ對(duì)小鼠胰島細(xì)胞有毒性作用，IFN-γ與TNF-α聯(lián)合刺激時(shí)，作用更明顯。
　　2.細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α對(duì)MIN6細(xì)胞具有毒性作用，并呈現(xiàn)