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文檔簡介
1、目的:甲基乙二醛(MGO)是葡萄糖活性代謝產(chǎn)物,晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)可抑制MGO代謝的關(guān)鍵酶乙二醛酶1(GLO-1)。MGO和晚期糖化終產(chǎn)物受體的水平在糖尿病人中明顯增高,與糖尿病加速動脈粥樣硬化有關(guān),但它們之間相互作用在糖尿病加速動脈粥樣硬化中的意義仍不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MGO誘導(dǎo)Jurkat細胞分泌炎癥因子TNF-α、IFN-γ。本實驗將進一步研究RAGE及其胞內(nèi)信號對MGO誘導(dǎo)的Jurkat細胞分泌TNF-α和I
2、FN-γ的影響,為了解糖尿病加速動脈粥樣硬化機制提供了實驗基礎(chǔ)。
方法:①不同濃度的MGO(0、15、30、60μM)作用PHA(0.25μg/ml)預(yù)刺激的Jurkat細胞24h,Western blot檢測RAGE表達。②不同濃度MGO(0、15、30、60μM)作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細胞24h,ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌;部分實驗加RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理,同時設(shè)非特異抗體(1μg/m
3、l)為對照。③不同濃度MGO(0、15、30、60μM)作用PHA預(yù)刺激的Jurkat細胞24h,Western blot測鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV(CaMKIV)的表達;部分實驗加RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理,同時設(shè)非特異抗體(1μg/ml)為對照。免疫熒光檢測30μM MGO作用0、15、30、60min后的Jurkat細胞內(nèi)CaMKIV轉(zhuǎn)核情況;部分實驗加RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理,同時設(shè)非特異抗體(1μg/ml)
4、為對照。④30μM MGO作用PHA預(yù)刺激24h的Jurkat細胞0、15、30、60min,Western blot檢測p38MAPK磷酸化表達;部分實驗加RAGE抗體(1μg/ml)預(yù)處理,同時設(shè)非特異抗體(1μg/ml)為對照。⑤30μM MGO作用于CaMKIV抑制劑KN62(10μM)、p38 MAPK抑制劑SB203580(25μM)預(yù)處理的Jurkat24h,ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌。
結(jié)果:①
5、MGO作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細胞24小時,Western Blot顯示Jurkat細胞表達RAGE,15、30、60μM MGO均上調(diào)RAGE的表達,與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②15、30、60μM MGO作用于Jurkat細胞24h可促使Jurkat細胞分泌TNF-α及IFN-γ,與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。RAGE抗體能抑制MGO誘導(dǎo)Jurkat細胞分泌TNF-α及IF
6、N-γ(p<0.05),而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)Jurkat細胞分泌TNF-α及IFN-γ無影響(p>0.05)。③15-60μM MGO能增加CaMKIV的表達,與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。RAGE抗體抑制MGO誘導(dǎo)的CaMKIV的表達(p<0.05);而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)CaMKIV的表達無影響(p>0.05)。免疫熒光顯示30μM MGO作用15-60min促進Jurkat細胞CaMKIV
7、核轉(zhuǎn)位;RAGE抗體抑制MGO誘導(dǎo)的CaMKIV蛋白核轉(zhuǎn)位,而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)CaMKIV蛋白核轉(zhuǎn)位無影響。④30μM MGO作用Jurkat細胞15-60min引起Jurkat細胞內(nèi)p38MAPK磷酸化表達增加(p<0.05);RAGE抗體抑制MGO引起的p38MAPK磷酸化(p<0.05),而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化無影響(p>0.05)。⑤CaMKIV,p38MAPK通路抑制劑預(yù)處理抑制MGO誘
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