自噬在IFN-γ調控FasL誘導血管平滑肌細胞凋亡中的作用機制.pdf

1、目的：探討自噬在IFN-γ促進FasL誘導血管平滑肌細胞凋亡中的作用及其相關分子機制。
　　方法：獲取SD大鼠胸主動脈，應用貼壁法分離并培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞，分別給予IFN-γ或/和FasL處理，采用細胞計數(shù)、FCM檢測以及蛋白印跡實驗分析法等實驗方法，檢測不同處理因素對血管平滑肌細胞凋亡的影響。采用免疫熒光和蛋白印跡等檢測方法，明確IFN-γ對血管平滑肌細胞自噬的誘導作用，并探討自噬與IFN-γ聯(lián)合FasL誘導血管平滑肌細胞凋

2、亡中的作用，采用FCM檢測血管平滑肌細胞表面Fas的蛋白水平，并用自噬抑制劑預處理細胞，探討明確自噬與血管平滑肌細胞膜表面 Fas表達的中的作用。用慢病毒介導轉染FAP-1shRNA以敲低FAP-1表達，用蛋白印跡實驗分析檢測載體用于細胞感染，獲得FAP-1低表達血管平滑肌細胞并用于實驗。以蛋白印跡實驗分析和FCM檢測血管平滑肌細胞內和膜表面Fas表達的水平，以明確FAP-1對細胞膜表面Fas表達以及IFN-γ聯(lián)合 FasL誘導調控細胞

3、凋亡的影響。采用蛋白印跡實驗分析Jak2/STAT1信號通路介導IFN-γ對細胞自噬調節(jié)作用。最后，再以不同抑制劑預處理平滑肌細胞，檢測在抑制劑存在的情況下，采用FCM分析IFN-γ對細胞膜表面Fas表達的影響，探討IFN-γ誘導血管平滑肌細胞自噬及Fas膜轉運的的分子機制。
　　結果：IFN-γ或FasL的單獨處理血管平滑肌細胞并不能誘導明顯細胞凋亡，然而，兩者聯(lián)合作用可明顯引起平滑肌細胞凋亡。IFN-γ處理后可以觀察到血管平滑

4、肌細胞內FAP-1的水平降低以及和細胞膜表面的Fas的表達增加，而自噬抑制劑預處理細胞能有效阻斷IFN-γ對FAP-1表達及細胞膜表面Fas蛋白水平的調節(jié)作用。同樣，敲低FAP-1基因表達也能使血管平滑肌細胞膜表面Fas的表達水平顯著增加。此外，血管平滑肌細胞經IFN-γ處理，可導致Jak2及STAT1的磷酸化水平增加，但是使用 Jak和 STAT1的抑制劑后，分別預處理細胞，能有效抑制IFN-γ誘導細胞自噬和Fas膜表面轉運。