人臍帶血間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究臍帶血來源的間充質(zhì)干細胞體外分離、純化及培養(yǎng)的條件，以建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)體系，滿足實驗和臨床的需要。
　　 2.探討臍血間充質(zhì)干細胞移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)，觀察其是否可以存活及對大鼠心功能的影響。
　　 方法：
　　 1.無菌條件下采取健康育齡產(chǎn)婦正常分娩胎兒的臍帶血42份，所有樣本均于采集8h內(nèi)分離。
　　 2.臍帶血42份隨機分成3組: FBS(胎牛血清)未包被組，F(xiàn)BS

2、包被組，Mesencult培養(yǎng)基組,每組12份。FBS未包被組和FBS包被組均使用含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，Mesencult培養(yǎng)基組使用培養(yǎng)干細胞專用的Mesencult培養(yǎng)基，與其添加物配合使用。3組均用Ficoll淋巴細胞分離液，密度梯度法分離臍血單個核細胞(MNC)，將單個核細胞按密度1 X 108/ml接種于T25培養(yǎng)瓶中3.培養(yǎng)瓶置37℃飽和濕度含5％CO2孵育箱培養(yǎng)，72h后全量換液，去除未貼壁細胞，以后均7天

3、換液一次。待細胞長到80％鋪滿瓶底時結(jié)束原代培養(yǎng)，按1:1進行消化傳代。觀察不同培養(yǎng)條件對臍血MSCs生長的影響。
　　 4.流式細胞術(shù)分析P2代細胞表面CD29、CD34、CD45、CD105標(biāo)志。
　　 5.將36只SD大鼠隨機分成MSCs移植組、假手術(shù)組和心肌梗死組各12只。結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備大鼠心肌梗死模型，1周后，經(jīng)尾靜脈注射帶DAPI標(biāo)記的臍血MSCs。
　　 6.4周后測定大鼠血流動力學(xué)，并行

4、免疫組織化學(xué)檢測移植細胞存活與分化情況及檢測梗死組織中FactorⅧ表達來比較三組微血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 1.實驗觀察顯示:經(jīng)典的MSCs培養(yǎng)方法，用未經(jīng)胎牛血清包被培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的MNC很少出現(xiàn)貼壁，且大多為形態(tài)多樣的混雜細胞，無明顯的細胞集落形成。在少數(shù)標(biāo)本中約2周后細胞可達到融合，主要表現(xiàn)為大的扁圓形細胞、破骨細胞和梭形成纖維樣的MSCs，盡管這些混雜細胞原代培養(yǎng)也可以達到融合，但其擴增能力明顯受到限制，且傳

5、代未達2代。而臍血單個核細胞在合適的培養(yǎng)基中，以較高的密度種植于經(jīng)胎牛血清包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，原代培養(yǎng)產(chǎn)生的貼壁細胞以間充質(zhì)干細胞為優(yōu)勢細胞，混雜有少量破骨樣細胞。而在Mesencult培養(yǎng)基下培養(yǎng)，經(jīng)傳代后這些貼壁細胞可以被純化為生長良好的間充質(zhì)干細胞。其能保持良好的擴增能力和均質(zhì)性。42份臍血中單個核細胞原代培養(yǎng)，其中僅8份傳代培養(yǎng)成功，而其中Mesencult條件培養(yǎng)基有5份培養(yǎng)成功，明顯高于經(jīng)典培養(yǎng)方法。原代和P2代臍血MSCs的生

6、長特性進行觀察比較，原代MSCs在接種后的2-8d為生長的潛伏期，10-14d以后細胞進入對數(shù)生長期，3-4周左右逐漸進入平臺期，P2代臍血MSCs擴增速度明顯快于原代培養(yǎng)，2-4d倍增1次，5-10d后細胞進入到對數(shù)生長期，10-14d進入平臺期。
　　 2.通過流式細胞儀檢測P2代的臍血MSCs結(jié)果顯示，P2代MSCs極弱表達CD34、CD45造血細胞標(biāo)志，穩(wěn)定地高表達CD29、CD105間充質(zhì)細胞相關(guān)的表面抗原。這與骨髓M

7、SCs的表面抗原標(biāo)志相一致。表明臍血MSCs是存在于臍血中區(qū)別于造血細胞的一群處于未分化狀態(tài)的非定向干/祖細胞。
　　 3.移植后4周，經(jīng)血流動力學(xué)檢測，與心梗組比較，MSCs移植組左室心功能明顯改善（P<0.05），移植組心肌組織中可以觀察到DAPI標(biāo)記細胞存在，但標(biāo)記細胞并未表達Troponin-T 及 connexin43，免疫組化染色檢測示MSCs移植組心肌微血管密度（MVD）明顯高于心梗組和假手術(shù)組。
　　 結(jié)