人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究臍帶血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化及培養(yǎng)的條件，以建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)體系，滿足實(shí)驗(yàn)和臨床的需要。
　　 2.探討臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)，觀察其是否可以存活及對(duì)大鼠心功能的影響。
　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下采取健康育齡產(chǎn)婦正常分娩胎兒的臍帶血42份，所有樣本均于采集8h內(nèi)分離。
　　 2.臍帶血42份隨機(jī)分成3組: FBS(胎牛血清)未包被組，F(xiàn)BS

2、包被組，Mesencult培養(yǎng)基組,每組12份。FBS未包被組和FBS包被組均使用含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，Mesencult培養(yǎng)基組使用培養(yǎng)干細(xì)胞專用的Mesencult培養(yǎng)基，與其添加物配合使用。3組均用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，將單個(gè)核細(xì)胞按密度1 X 108/ml接種于T25培養(yǎng)瓶中3.培養(yǎng)瓶置37℃飽和濕度含5％CO2孵育箱培養(yǎng)，72h后全量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后均7天

3、換液一次。待細(xì)胞長(zhǎng)到80％鋪滿瓶底時(shí)結(jié)束原代培養(yǎng)，按1:1進(jìn)行消化傳代。觀察不同培養(yǎng)條件對(duì)臍血MSCs生長(zhǎng)的影響。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)分析P2代細(xì)胞表面CD29、CD34、CD45、CD105標(biāo)志。
　　 5.將36只SD大鼠隨機(jī)分成MSCs移植組、假手術(shù)組和心肌梗死組各12只。結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備大鼠心肌梗死模型，1周后，經(jīng)尾靜脈注射帶DAPI標(biāo)記的臍血MSCs。
　　 6.4周后測(cè)定大鼠血流動(dòng)力學(xué)，并行

4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植細(xì)胞存活與分化情況及檢測(cè)梗死組織中FactorⅧ表達(dá)來(lái)比較三組微血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 1.實(shí)驗(yàn)觀察顯示:經(jīng)典的MSCs培養(yǎng)方法，用未經(jīng)胎牛血清包被培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的MNC很少出現(xiàn)貼壁，且大多為形態(tài)多樣的混雜細(xì)胞，無(wú)明顯的細(xì)胞集落形成。在少數(shù)標(biāo)本中約2周后細(xì)胞可達(dá)到融合，主要表現(xiàn)為大的扁圓形細(xì)胞、破骨細(xì)胞和梭形成纖維樣的MSCs，盡管這些混雜細(xì)胞原代培養(yǎng)也可以達(dá)到融合，但其擴(kuò)增能力明顯受到限制，且傳

5、代未達(dá)2代。而臍血單個(gè)核細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中，以較高的密度種植于經(jīng)胎牛血清包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，原代培養(yǎng)產(chǎn)生的貼壁細(xì)胞以間充質(zhì)干細(xì)胞為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，混雜有少量破骨樣細(xì)胞。而在Mesencult培養(yǎng)基下培養(yǎng)，經(jīng)傳代后這些貼壁細(xì)胞可以被純化為生長(zhǎng)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞。其能保持良好的擴(kuò)增能力和均質(zhì)性。42份臍血中單個(gè)核細(xì)胞原代培養(yǎng)，其中僅8份傳代培養(yǎng)成功，而其中Mesencult條件培養(yǎng)基有5份培養(yǎng)成功，明顯高于經(jīng)典培養(yǎng)方法。原代和P2代臍血MSCs的生

6、長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察比較，原代MSCs在接種后的2-8d為生長(zhǎng)的潛伏期，10-14d以后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3-4周左右逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，P2代臍血MSCs擴(kuò)增速度明顯快于原代培養(yǎng)，2-4d倍增1次，5-10d后細(xì)胞進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10-14d進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 2.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)P2代的臍血MSCs結(jié)果顯示，P2代MSCs極弱表達(dá)CD34、CD45造血細(xì)胞標(biāo)志，穩(wěn)定地高表達(dá)CD29、CD105間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的表面抗原。這與骨髓M

7、SCs的表面抗原標(biāo)志相一致。表明臍血MSCs是存在于臍血中區(qū)別于造血細(xì)胞的一群處于未分化狀態(tài)的非定向干/祖細(xì)胞。
　　 3.移植后4周，經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，與心梗組比較，MSCs移植組左室心功能明顯改善（P<0.05），移植組心肌組織中可以觀察到DAPI標(biāo)記細(xì)胞存在，但標(biāo)記細(xì)胞并未表達(dá)Troponin-T 及 connexin43，免疫組化染色檢測(cè)示MSCs移植組心肌微血管密度（MVD）明顯高于心梗組和假手術(shù)組。
　　 結(jié)