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1、目的:
本課題組前期采用分子對(duì)接的方法,篩選出以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的咪唑類(lèi)化合物6,其在體外展示出較好的抗菌活性,但其體內(nèi)保護(hù)效果不理想,且細(xì)胞毒性較高。本研究擬以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域(CA結(jié)構(gòu)域)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸功能殘基為藥物作用靶點(diǎn),采用化合物6為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板,設(shè)計(jì)并合成一系列新型咪唑類(lèi)抗菌化合物。通過(guò)化合物和三種不同的WalK蛋白相互作用,驗(yàn)證新型化合物抗菌靶點(diǎn)
2、位于肺炎鏈球菌WalK酶CA結(jié)構(gòu)域;通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)考查化合物抗菌活性及毒性反應(yīng);通過(guò)建立小鼠肺炎鏈球菌感染模型,檢測(cè)其體內(nèi)抗菌效應(yīng)。本研究擬最終獲得毒性小、體內(nèi)抗菌活性高、可能具有廣譜抗革蘭陽(yáng)性菌的新型抗菌藥物。
方法:
本課題擬通過(guò)分子設(shè)計(jì)—合成—生物活性測(cè)試模式,采用活性基團(tuán)拼接法和取代法,合成一系列新型咪唑類(lèi)抗菌藥物;再對(duì)合成的咪唑類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行元素、1H NMR、13C NMR、MS(ESI)、熔點(diǎn)、遠(yuǎn)紅外光譜
3、等表征分析。利用PCR法擴(kuò)增3種不同肺炎鏈球菌WalK基因序列(全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域),并構(gòu)建3種WalK基因序列的重組ppSUMO質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,依靠IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni-NTA親和層析,得到純度較高的可溶性目的蛋白;利用該蛋白免疫BALB/C小鼠獲取多克隆抗體,經(jīng)ELISA法檢測(cè)其特異性IgG抗體效價(jià),經(jīng)Western Blot鑒定WalK全長(zhǎng)蛋白在4種S.pn血清型菌株中的保守性。利
4、用ATP激酶發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)以上三種蛋白的激酶活性,檢測(cè)蛋白與新型咪唑類(lèi)化合物作用后的激酶活性變化(IC50)。通過(guò)最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的體外抗菌效應(yīng)以及細(xì)胞毒性作用。構(gòu)建BALB/C小鼠的腹腔S.pn感染模型,通過(guò)尾靜脈注射途徑給藥,觀察小鼠的生存時(shí)間和生存率。
結(jié)果:
本課題組前期已經(jīng)成功合成以原始化合物6為母體的15種新型咪唑類(lèi)化合物,并對(duì)其
5、中的6種化合物進(jìn)行了1H NMR、13C NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜、熔點(diǎn)等結(jié)構(gòu)和組成表征分析,結(jié)果提示為預(yù)期目標(biāo)分子。成功構(gòu)建和表達(dá)WalK(全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域)重組蛋白;以全長(zhǎng)WalK蛋白免疫小鼠后獲得高滴度的多克隆抗體,Western Blot分析證實(shí),CMCC(B)31207、CMCC(B)31203、CMCC(B)31693、NTCC7466(D39)等4種S.pn菌株均能穩(wěn)定的表達(dá)WalK全長(zhǎng)蛋白。隨著
6、新型咪唑類(lèi)化合物(2號(hào)、4號(hào)及5號(hào))藥物濃度的逐漸增高,WalK全長(zhǎng)組和僅含有CA結(jié)構(gòu)域組ATP激酶活性均持續(xù)降低(均P<0.05);而不同濃度的新型咪唑類(lèi)化合物(2號(hào)、4號(hào)及5號(hào))與缺陷CA結(jié)構(gòu)域組作用,其ATP激酶活性變化無(wú)明顯差異(P>0.05)。通過(guò)最小抑菌濃度、最小殺菌濃度等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),新合成咪唑類(lèi)化合物2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)均具有較好的抑菌及殺菌效應(yīng),其中4號(hào)化合物抑菌及殺菌效果最為明顯(P<0.01);細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí),三種化
7、合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物(P<0.01),其中以2號(hào)細(xì)胞毒性最低(1170μM)?;衔飳?duì)腹腔感染D39型肺炎鏈球菌小鼠的治療效果證實(shí),與陽(yáng)性對(duì)照組(PNC組)比較,原始化合物6號(hào)、新合成咪唑類(lèi)化合物4號(hào)、5號(hào)的保護(hù)效果均未見(jiàn)明顯差異(均P>0.05);2號(hào)化合物與陽(yáng)性對(duì)照組間比較其保護(hù)效果明顯降低(P<0.05)。
結(jié)論:
WalK全長(zhǎng)重組蛋白在不同血清型S.pn中保守性較好,新合成咪唑類(lèi)化合物(2號(hào)、4號(hào)
8、及5號(hào))具有抑制WalK酶CA結(jié)構(gòu)域ATP激酶活性的效應(yīng);最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗(yàn)均證實(shí)4號(hào)化合物在體外具有極佳的抗菌及殺菌效應(yīng);細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)以2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)化合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物;體內(nèi)抗菌效應(yīng)試驗(yàn)提示新合成的咪唑類(lèi)化合物4號(hào)、5號(hào)均能夠明顯延長(zhǎng)腹腔感染肺炎鏈球菌D39小鼠的生存時(shí)間。
本研究首次證實(shí)新合成的4號(hào)咪唑類(lèi)化合物可能是未來(lái)治療肺炎鏈球菌感染的新型藥物,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將著重其藥物代謝學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)方
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