肺炎鏈球菌檢測

1、肺炎鏈球菌檢測,培養(yǎng)、鑒定、分型,簡介,肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）簡稱肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分別在法國及美國從患者痰液中分離出。為革蘭染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜。5%～10%正常人上呼吸道中攜帶此菌。有毒株是引起人類疾病的重要病原菌。,標

2、本中SP形態(tài),形態(tài)：矛頭狀 排列：成雙排列 特殊結構：可有莢膜,分布,在自然界中分布廣泛，常生活在正常人的鼻咽部，多數不致病或致病力很弱，少數致病力較強。在免疫力下降時致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒，年老體弱者易導致肺部感染。無論從哪種標本中分離出肺炎鏈球菌，均應及時報告。,國外感染情況,在美國，每年侵襲性SP感染的發(fā)生率為72-103/10萬兒童，而歐洲為10-24/10萬兒童/年。每年約有600多萬例中耳炎由SP引起，

3、占急性中耳炎30-50％；在發(fā)展中國家，每年約有500萬5歲以下兒童死于SP引起的肺炎，10-50萬兒童死于SP引起的腦膜炎。（2005年）,國內情況,國內最早兒童肺炎鏈球菌腦膜炎個案報告在1942年。60年代中期以前研究資料顯示SP肺炎、腦膜炎在冬春季發(fā)病較多，兒科住院病人中常見病例多發(fā)生在嬰幼兒。SP性腦膜炎占化腦的11.1-22.1％，僅次于流腦。SP也是小兒肺炎的重要病原菌之一，SP所致大葉性肺炎，5歲以下兒童中可占70％,國內

4、情況,80年代后的研究資料顯示SP腦膜炎占同期化腦的79.8％。SP引起的敗血癥還是少見，約占5％左右。一項13歲以下兒童中耳炎病原學研究顯示SP引起的感染占病例31.7％，是最常見的病原菌。,廣東地區(qū)情況,我院2006年參與惠氏《中國住院兒童肺炎流行病學調查》研究，從入選的1097例肺炎住院兒童的痰標本中檢出肺炎鏈球菌79例，檢出率為7.2%。（中國抗感染化療雜志）我院2005年-2007年檢出313株SP，10株來自血液培養(yǎng)（10

5、/513），腦脊液25株（25/113），中耳炎患兒的炎癥分泌物檢出26株SP（26/133），來自呼吸道感染患兒的痰或咽拭子標本的SP有252株（252/1412）。（廣東醫(yī)學）,廣東地區(qū)情況,我院2005-2009年從化膿性腦膜炎患者腦脊液中共檢出81株SP（24.18%，81/335）。（臨床兒科雜志）我院2011-2012年從中耳炎患者耳分泌物中檢出270株SP（36.78%，270/734）。我院2012年從五官科腺樣體手

6、術病人的腺樣體或扁桃體組織中檢出SP104株（40.78%，104/255）。,致病性,在化膿性球菌中，肺炎鏈球菌的致病力僅次于金黃色葡萄球菌。 肺炎球菌主要的致病物質 有莢膜，肺炎鏈球菌溶素O，脂磷壁酸和神經氨酸酶等。莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據。所致疾病 主要引起大葉性肺炎，成人中75%由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半數以上為1,2,3型。3型產生大量莢膜物質，毒力強，病死率高。兒童以第6,14,19及

7、23型肺炎鏈球菌感染最常見.可繼發(fā)胸膜炎，膿胸，中耳炎，腦膜炎和敗血癥等。,肺炎鏈球菌感染的臨床癥狀,在兒童起病多急驟（少數患兒先有輕微的上呼吸道感染癥狀），中毒癥狀重。突然高熱、體溫可達40℃～41℃，頭痛、胸痛、呼吸急促，煩躁不安，早期往往不咳嗽或輕咳，病兒常不吐痰。年長兒可有寒戰(zhàn)、咯吐鐵銹色痰，但有的患兒仍咳黃膿痰。重癥患兒可有驚厥、譫妄及昏迷等中毒性腦病的表現 。,實驗室常規(guī)檢測,標本來源 痰、咽拭子、中耳分泌物、血液、腦脊液等

8、。分離培養(yǎng) 血瓊脂培養(yǎng)基。初次分離最好提供5%-10%CO2。常規(guī)鑒定 Option敏感試驗、菊糖發(fā)酵試驗、膽汁溶菌試驗等。,SP培養(yǎng)呼吸道標本的采集,1.抗菌藥物使用前取材；2.最好清晨采取痰標本；3.疑似細菌性肺炎患者痰標本每天一次，連續(xù)2-3天，不建議24h內多次送檢，除非痰液外觀性狀發(fā)生明顯改變；4.自然咳痰法取樣可用于成人，先應刷牙、清水漱口，量不少于1mL；,SP培養(yǎng)呼吸道標本的采集,5.兒童以支氣管鏡抽吸為佳，肺

9、泡灌洗液也不錯，或者用彎壓舌板壓舌，棉拭子伸入咽部取樣（臨床醫(yī)生操作）；6.其他的經人工氣道吸引分泌物、穿刺取樣、胃內取樣均可以取得合格標本（臨床醫(yī)生操作）。,SP培養(yǎng)呼吸道標本的運輸和保存,盡快送檢，要求2h內送到；肺炎鏈球菌延遲送檢極有可能死亡，而且不適合4℃保存；標本處理前檢測是否合格。 痰標本合格的標準： 痰標本鱗狀上皮細胞 白血球 細菌種類 合格 =10 1

10、-3種 不合格 >=25/低倍 3種,培養(yǎng)特性,初次分離需要CO2，采用CO2培養(yǎng)箱較好；18-24h形成細小、圓形、濕潤、自溶的菌落，有草綠色溶血環(huán)。有少數菌株呈黏液型或顆粒狀。最好選用新鮮綿羊血的BAP，有效期應該注意，不像標示的有效期那么長。加慶大霉素的血瓊脂平板：在普通血瓊脂中加入抑制劑慶大霉素注射液，混勻傾倒平板，瓊脂中慶大霉素最后濃度相當于1.25 mg/250mL。,粘液性菌落,,SP

11、常見菌落,,鑒定,Optochin（乙基羥化奎寧，奧普托新）敏感（生長抑制）試驗：在涂布細菌的血瓊脂平板上貼5μg的Optochin紙片，35℃有氧環(huán)境下過夜，出現≥14mm的抑菌環(huán)為敏感，草綠色鏈球菌僅小抑菌環(huán)或無抑菌環(huán)，肺炎鏈球菌有少數菌株不敏感。 對疑似OP不敏感的肺炎鏈球菌可用膽汁溶菌試驗鑒定。,OP敏感,,鑒定,膽鹽溶菌試驗：滴加膽汁酸鹽在血平板上生長的菌落上，置37℃10-30min，可以看到滴加試劑的部位菌落溶化。

12、 試管法：在0.9mL隔夜培養(yǎng)液中加入0.1mL去氧膽酸鈉溶液，37℃水浴10～30分鐘，培養(yǎng)液由濁變清為陽性。用生理鹽水代替去氧膽酸鈉溶液作陰性對照。能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、菊糖等多種糖類，不分解甘露醇、山梨醇。,鑒定,有明顯的菌落特征：中心凹陷（自溶）。不典型菌落與其他非β溶血鏈球菌鑒別肺炎鏈球菌：OP敏感、膽汁溶菌陽性、膽汁七葉苷陰性；草綠色鏈球菌：三個試驗均陰性；牛鏈球菌：OP和膽汁溶菌陰性，膽汁七葉苷陽性。

13、,SP菌種保存,保存液配制 TSB 3g，甘油25mL，蒸餾水100mL，滅菌后加入無菌馬血清100mL，分裝在無菌干燥管。保存 挑選新鮮培養(yǎng)物置于保存管中，-76℃保存。復活 取出保存管自然平衡至室溫，接種適合平板。,SP血清學分型：,肺炎鏈球菌的血清分型可以為肺炎鏈球菌疫苗研究提供可靠依據，也是一種流行病學調查手段。肺炎鏈球菌的抗原成分較多，有菌體核蛋白、菌體種屬特異性抗原、莢膜多糖抗原等。,SP血清學分型,莢膜多

14、糖抗原：亦稱型特異性抗原，存在于肺炎鏈球菌的莢膜中，由大量多聚體組成，能溶于水，有型特異性，故稱之為可溶性特異性物質（SSS）。不同菌株所含莢膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和莢膜腫脹試驗，進行肺炎鏈球菌分型。目前至少可將有莢膜的肺炎鏈球菌分成83個血清型。,血清分型,丹麥Statens Serum Copenhagen公司產pneumotest-kit 23價標準血清分型試劑盒；原理：莢膜腫脹試驗；觀察：相差顯微鏡觀察最好，可以看到菌

15、體周圍有一無色寬厚的環(huán)狀莢膜。,血清分型,我們的做法：以亞甲藍染色，普通顯微鏡可以觀察，菌體藍色，周圍有一圈著色較淺的寬的莢膜。,血清分型：,1 細菌復蘇：將肺炎鏈球菌凍存管從-76℃冰箱取出，挑取3-5μL菌液接種于普通羊血培養(yǎng)基，35℃、5%CO2培養(yǎng)18-24小時，挑取單個菌落做次代培養(yǎng)。2 配制PBS溶液，并分裝小試管，每管約0.5mL，用亞甲藍粉配制0.1％的亞甲藍試劑。,SP血清學分型步驟：,3 用接種環(huán)挑取經次代培養(yǎng)后的

16、肺炎鏈球菌菌落，放入小試管中，制成菌懸液約0.5麥氏單位濃度。4 用接種環(huán)挑取約10μL菌懸液放入載玻片上，再挑取同量的診斷血清（10μl）放入載玻片上，并與菌懸液攪拌混勻。,SP血清學分型步驟：,5 再加入一接種環(huán)0.1％的亞甲藍溶液放入載玻片上與抗血清混勻一分鐘，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現。6 出現凝集或莢膜腫脹的抗血清型即為該肺炎鏈球菌的血清型。,常見的血清型：,常引起人類疾病的血清型20多種，最常見的血清

17、型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。國內兒童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。,國內兒童的血清型流行情況：,7價疫苗和13價疫苗比較,7價疫苗： 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13價疫苗： 以上7價加上1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。,疫苗涵蓋（100％）,肺炎鏈球菌血清型流行趨勢,肺炎鏈球菌的血清型分布隨國家和年齡組的變化不大，歐洲國家和美

18、國有著相似的血清型分布，美國的常見血清型依次為6B、19F、23F、14、18C，荷蘭常見的血清型分布依次為19F 、6B、6A、9V、23F。亞洲的情況略有不同，韓國以15、14、6B、19F較普遍，而印度以6、14、19、15型較多見。（2006年）,SP的藥物敏感性,除萬古霉素外，對其他藥物均有耐藥性菌株出現；對青霉素的耐藥不是β-內酰胺酶引起，不能用β-內酰胺酶試驗來預測青霉素的敏感性；青霉素的敏感性可以用1μg的苯唑西林

19、（OX）紙片檢測，抑菌環(huán)≥20mm，表示對青霉素敏感，對頭孢曲松和頭孢噻肟也敏感；,肺炎鏈球菌的藥物敏感性,OX抑菌環(huán)<20mm時應該檢測青霉素的MIC；篩選青霉素的耐藥性只用1μgOX，不能以甲氧西林或青霉素紙片代替，防止假敏感性出現；藥敏試驗的培養(yǎng)基：加5%脫纖維羊血的MH平板。,敏感性預測,青霉素MIC 能預報對其他β-內酰胺類敏感性： 青霉素MIC≤0.06μg/ml（或苯唑西林的抑菌環(huán)≥20mm）提示分離株對氨芐西

20、林（口服或注射）、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢泊肟、頭孢丙烯、頭孢唑肟、頭孢呋辛、亞胺培南、氯碳頭孢和美洛培南等敏感。 青霉素MIC≤2μg/ml 提示對阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松和厄他培南等敏感。,本地耐藥情況趨勢：,廣東地區(qū)兒童PRSP低于匈牙利、韓國、臺灣，與香港接近，高于上海、北京，表明廣州地區(qū)兒童鼻咽部肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥情況較為嚴重，且有上升趨勢，可能與濫用抗生素

21、，使細菌產生誘導性耐藥有關，也可能由于青霉素不敏感克隆株在國內的傳播和蔓延。,本地區(qū)耐藥情況,大環(huán)內脂類抗生素的耐藥情況較為嚴重，其中紅霉素的耐藥率達80.5%， 且多數為高度耐藥， 其中59%的菌株MIC為256μg/ml，其耐藥情況與杭州地區(qū)的紅霉素的耐藥率90.1%、74%的菌株MIC為256μg/ml比要低，大環(huán)內酯類抗生素的廣泛使用可能是造成其耐藥率增加的重要原因；,本地區(qū)耐藥情況,對紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明、 克