肺炎鏈球菌檢測(cè)

1、肺炎鏈球菌檢測(cè),培養(yǎng)、鑒定、分型,簡(jiǎn)介,肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）簡(jiǎn)稱肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分別在法國(guó)及美國(guó)從患者痰液中分離出。為革蘭染色陽(yáng)性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學(xué)成分為多糖的莢膜。5%～10%正常人上呼吸道中攜帶此菌。有毒株是引起人類疾病的重要病原菌。,標(biāo)

2、本中SP形態(tài),形態(tài)：矛頭狀 排列：成雙排列 特殊結(jié)構(gòu)：可有莢膜,分布,在自然界中分布廣泛，常生活在正常人的鼻咽部，多數(shù)不致病或致病力很弱，少數(shù)致病力較強(qiáng)。在免疫力下降時(shí)致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒，年老體弱者易導(dǎo)致肺部感染。無(wú)論從哪種標(biāo)本中分離出肺炎鏈球菌，均應(yīng)及時(shí)報(bào)告。,國(guó)外感染情況,在美國(guó)，每年侵襲性SP感染的發(fā)生率為72-103/10萬(wàn)兒童，而歐洲為10-24/10萬(wàn)兒童/年。每年約有600多萬(wàn)例中耳炎由SP引起，

3、占急性中耳炎30-50％；在發(fā)展中國(guó)家，每年約有500萬(wàn)5歲以下兒童死于SP引起的肺炎，10-50萬(wàn)兒童死于SP引起的腦膜炎。（2005年）,國(guó)內(nèi)情況,國(guó)內(nèi)最早兒童肺炎鏈球菌腦膜炎個(gè)案報(bào)告在1942年。60年代中期以前研究資料顯示SP肺炎、腦膜炎在冬春季發(fā)病較多，兒科住院病人中常見(jiàn)病例多發(fā)生在嬰幼兒。SP性腦膜炎占化腦的11.1-22.1％，僅次于流腦。SP也是小兒肺炎的重要病原菌之一，SP所致大葉性肺炎，5歲以下兒童中可占70％,國(guó)內(nèi)

4、情況,80年代后的研究資料顯示SP腦膜炎占同期化腦的79.8％。SP引起的敗血癥還是少見(jiàn)，約占5％左右。一項(xiàng)13歲以下兒童中耳炎病原學(xué)研究顯示SP引起的感染占病例31.7％，是最常見(jiàn)的病原菌。,廣東地區(qū)情況,我院2006年參與惠氏《中國(guó)住院兒童肺炎流行病學(xué)調(diào)查》研究，從入選的1097例肺炎住院兒童的痰標(biāo)本中檢出肺炎鏈球菌79例，檢出率為7.2%。（中國(guó)抗感染化療雜志）我院2005年-2007年檢出313株SP，10株來(lái)自血液培養(yǎng)（10

5、/513），腦脊液25株（25/113），中耳炎患兒的炎癥分泌物檢出26株SP（26/133），來(lái)自呼吸道感染患兒的痰或咽拭子標(biāo)本的SP有252株（252/1412）。（廣東醫(yī)學(xué)）,廣東地區(qū)情況,我院2005-2009年從化膿性腦膜炎患者腦脊液中共檢出81株SP（24.18%，81/335）。（臨床兒科雜志）我院2011-2012年從中耳炎患者耳分泌物中檢出270株SP（36.78%，270/734）。我院2012年從五官科腺樣體手

6、術(shù)病人的腺樣體或扁桃體組織中檢出SP104株（40.78%，104/255）。,致病性,在化膿性球菌中，肺炎鏈球菌的致病力僅次于金黃色葡萄球菌。 肺炎球菌主要的致病物質(zhì) 有莢膜，肺炎鏈球菌溶素O，脂磷壁酸和神經(jīng)氨酸酶等。莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據(jù)。所致疾病 主要引起大葉性肺炎，成人中75%由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半數(shù)以上為1,2,3型。3型產(chǎn)生大量莢膜物質(zhì)，毒力強(qiáng)，病死率高。兒童以第6,14,19及

7、23型肺炎鏈球菌感染最常見(jiàn).可繼發(fā)胸膜炎，膿胸，中耳炎，腦膜炎和敗血癥等。,肺炎鏈球菌感染的臨床癥狀,在兒童起病多急驟（少數(shù)患兒先有輕微的上呼吸道感染癥狀），中毒癥狀重。突然高熱、體溫可達(dá)40℃～41℃，頭痛、胸痛、呼吸急促，煩躁不安，早期往往不咳嗽或輕咳，病兒常不吐痰。年長(zhǎng)兒可有寒戰(zhàn)、咯吐鐵銹色痰，但有的患兒仍咳黃膿痰。重癥患兒可有驚厥、譫妄及昏迷等中毒性腦病的表現(xiàn) 。,實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè),標(biāo)本來(lái)源 痰、咽拭子、中耳分泌物、血液、腦脊液等

8、。分離培養(yǎng) 血瓊脂培養(yǎng)基。初次分離最好提供5%-10%CO2。常規(guī)鑒定 Option敏感試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)等。,SP培養(yǎng)呼吸道標(biāo)本的采集,1.抗菌藥物使用前取材；2.最好清晨采取痰標(biāo)本；3.疑似細(xì)菌性肺炎患者痰標(biāo)本每天一次，連續(xù)2-3天，不建議24h內(nèi)多次送檢，除非痰液外觀性狀發(fā)生明顯改變；4.自然咳痰法取樣可用于成人，先應(yīng)刷牙、清水漱口，量不少于1mL；,SP培養(yǎng)呼吸道標(biāo)本的采集,5.兒童以支氣管鏡抽吸為佳，肺

9、泡灌洗液也不錯(cuò)，或者用彎壓舌板壓舌，棉拭子伸入咽部取樣（臨床醫(yī)生操作）；6.其他的經(jīng)人工氣道吸引分泌物、穿刺取樣、胃內(nèi)取樣均可以取得合格標(biāo)本（臨床醫(yī)生操作）。,SP培養(yǎng)呼吸道標(biāo)本的運(yùn)輸和保存,盡快送檢，要求2h內(nèi)送到；肺炎鏈球菌延遲送檢極有可能死亡，而且不適合4℃保存；標(biāo)本處理前檢測(cè)是否合格。 痰標(biāo)本合格的標(biāo)準(zhǔn)： 痰標(biāo)本鱗狀上皮細(xì)胞 白血球 細(xì)菌種類 合格 =10 1

10、-3種 不合格 >=25/低倍 3種,培養(yǎng)特性,初次分離需要CO2，采用CO2培養(yǎng)箱較好；18-24h形成細(xì)小、圓形、濕潤(rùn)、自溶的菌落，有草綠色溶血環(huán)。有少數(shù)菌株呈黏液型或顆粒狀。最好選用新鮮綿羊血的BAP，有效期應(yīng)該注意，不像標(biāo)示的有效期那么長(zhǎng)。加慶大霉素的血瓊脂平板：在普通血瓊脂中加入抑制劑慶大霉素注射液，混勻傾倒平板，瓊脂中慶大霉素最后濃度相當(dāng)于1.25 mg/250mL。,粘液性菌落,,SP

11、常見(jiàn)菌落,,鑒定,Optochin（乙基羥化奎寧，奧普托新）敏感（生長(zhǎng)抑制）試驗(yàn)：在涂布細(xì)菌的血瓊脂平板上貼5μg的Optochin紙片，35℃有氧環(huán)境下過(guò)夜，出現(xiàn)≥14mm的抑菌環(huán)為敏感，草綠色鏈球菌僅小抑菌環(huán)或無(wú)抑菌環(huán)，肺炎鏈球菌有少數(shù)菌株不敏感。 對(duì)疑似OP不敏感的肺炎鏈球菌可用膽汁溶菌試驗(yàn)鑒定。,OP敏感,,鑒定,膽鹽溶菌試驗(yàn)：滴加膽汁酸鹽在血平板上生長(zhǎng)的菌落上，置37℃10-30min，可以看到滴加試劑的部位菌落溶化。

12、 試管法：在0.9mL隔夜培養(yǎng)液中加入0.1mL去氧膽酸鈉溶液，37℃水浴10～30分鐘，培養(yǎng)液由濁變清為陽(yáng)性。用生理鹽水代替去氧膽酸鈉溶液作陰性對(duì)照。能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、菊糖等多種糖類，不分解甘露醇、山梨醇。,鑒定,有明顯的菌落特征：中心凹陷（自溶）。不典型菌落與其他非β溶血鏈球菌鑒別肺炎鏈球菌：OP敏感、膽汁溶菌陽(yáng)性、膽汁七葉苷陰性；草綠色鏈球菌：三個(gè)試驗(yàn)均陰性；牛鏈球菌：OP和膽汁溶菌陰性，膽汁七葉苷陽(yáng)性。

13、,SP菌種保存,保存液配制 TSB 3g，甘油25mL，蒸餾水100mL，滅菌后加入無(wú)菌馬血清100mL，分裝在無(wú)菌干燥管。保存 挑選新鮮培養(yǎng)物置于保存管中，-76℃保存。復(fù)活 取出保存管自然平衡至室溫，接種適合平板。,SP血清學(xué)分型：,肺炎鏈球菌的血清分型可以為肺炎鏈球菌疫苗研究提供可靠依據(jù)，也是一種流行病學(xué)調(diào)查手段。肺炎鏈球菌的抗原成分較多，有菌體核蛋白、菌體種屬特異性抗原、莢膜多糖抗原等。,SP血清學(xué)分型,莢膜多

14、糖抗原：亦稱型特異性抗原，存在于肺炎鏈球菌的莢膜中，由大量多聚體組成，能溶于水，有型特異性，故稱之為可溶性特異性物質(zhì)（SSS）。不同菌株所含莢膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和莢膜腫脹試驗(yàn)，進(jìn)行肺炎鏈球菌分型。目前至少可將有莢膜的肺炎鏈球菌分成83個(gè)血清型。,血清分型,丹麥Statens Serum Copenhagen公司產(chǎn)pneumotest-kit 23價(jià)標(biāo)準(zhǔn)血清分型試劑盒；原理：莢膜腫脹試驗(yàn)；觀察：相差顯微鏡觀察最好，可以看到菌

15、體周圍有一無(wú)色寬厚的環(huán)狀莢膜。,血清分型,我們的做法：以亞甲藍(lán)染色，普通顯微鏡可以觀察，菌體藍(lán)色，周圍有一圈著色較淺的寬的莢膜。,血清分型：,1 細(xì)菌復(fù)蘇：將肺炎鏈球菌凍存管從-76℃冰箱取出，挑取3-5μL菌液接種于普通羊血培養(yǎng)基，35℃、5%CO2培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取單個(gè)菌落做次代培養(yǎng)。2 配制PBS溶液，并分裝小試管，每管約0.5mL，用亞甲藍(lán)粉配制0.1％的亞甲藍(lán)試劑。,SP血清學(xué)分型步驟：,3 用接種環(huán)挑取經(jīng)次代培養(yǎng)后的

16、肺炎鏈球菌菌落，放入小試管中，制成菌懸液約0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛取? 用接種環(huán)挑取約10μL菌懸液放入載玻片上，再挑取同量的診斷血清（10μl）放入載玻片上，并與菌懸液攪拌混勻。,SP血清學(xué)分型步驟：,5 再加入一接種環(huán)0.1％的亞甲藍(lán)溶液放入載玻片上與抗血清混勻一分鐘，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現(xiàn)。6 出現(xiàn)凝集或莢膜腫脹的抗血清型即為該肺炎鏈球菌的血清型。,常見(jiàn)的血清型：,常引起人類疾病的血清型20多種，最常見(jiàn)的血清

17、型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。國(guó)內(nèi)兒童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。,國(guó)內(nèi)兒童的血清型流行情況：,7價(jià)疫苗和13價(jià)疫苗比較,7價(jià)疫苗： 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13價(jià)疫苗： 以上7價(jià)加上1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。,疫苗涵蓋（100％）,肺炎鏈球菌血清型流行趨勢(shì),肺炎鏈球菌的血清型分布隨國(guó)家和年齡組的變化不大，歐洲國(guó)家和美

18、國(guó)有著相似的血清型分布，美國(guó)的常見(jiàn)血清型依次為6B、19F、23F、14、18C，荷蘭常見(jiàn)的血清型分布依次為19F 、6B、6A、9V、23F。亞洲的情況略有不同，韓國(guó)以15、14、6B、19F較普遍，而印度以6、14、19、15型較多見(jiàn)。（2006年）,SP的藥物敏感性,除萬(wàn)古霉素外，對(duì)其他藥物均有耐藥性菌株出現(xiàn)；對(duì)青霉素的耐藥不是β-內(nèi)酰胺酶引起，不能用β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)青霉素的敏感性；青霉素的敏感性可以用1μg的苯唑西林

19、（OX）紙片檢測(cè)，抑菌環(huán)≥20mm，表示對(duì)青霉素敏感，對(duì)頭孢曲松和頭孢噻肟也敏感；,肺炎鏈球菌的藥物敏感性,OX抑菌環(huán)<20mm時(shí)應(yīng)該檢測(cè)青霉素的MIC；篩選青霉素的耐藥性只用1μgOX，不能以甲氧西林或青霉素紙片代替，防止假敏感性出現(xiàn)；藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基：加5%脫纖維羊血的MH平板。,敏感性預(yù)測(cè),青霉素MIC 能預(yù)報(bào)對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類敏感性： 青霉素MIC≤0.06μg/ml（或苯唑西林的抑菌環(huán)≥20mm）提示分離株對(duì)氨芐西

20、林（口服或注射）、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢泊肟、頭孢丙烯、頭孢唑肟、頭孢呋辛、亞胺培南、氯碳頭孢和美洛培南等敏感。 青霉素MIC≤2μg/ml 提示對(duì)阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松和厄他培南等敏感。,本地耐藥情況趨勢(shì)：,廣東地區(qū)兒童PRSP低于匈牙利、韓國(guó)、臺(tái)灣，與香港接近，高于上海、北京，表明廣州地區(qū)兒童鼻咽部肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥情況較為嚴(yán)重，且有上升趨勢(shì)，可能與濫用抗生素

21、，使細(xì)菌產(chǎn)生誘導(dǎo)性耐藥有關(guān)，也可能由于青霉素不敏感克隆株在國(guó)內(nèi)的傳播和蔓延。,本地區(qū)耐藥情況,大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的耐藥情況較為嚴(yán)重，其中紅霉素的耐藥率達(dá)80.5%， 且多數(shù)為高度耐藥， 其中59%的菌株MIC為256μg/ml，其耐藥情況與杭州地區(qū)的紅霉素的耐藥率90.1%、74%的菌株MIC為256μg/ml比要低，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛使用可能是造成其耐藥率增加的重要原因；,本地區(qū)耐藥情況,對(duì)紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、 克