肺炎鏈球菌DHBPs的結構和功能研究.pdf

1、目的：核黃素(riboflavin)是輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide,FAD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前體物[1,2,3],對生物體的生物合成至關重要。研究發(fā)現(xiàn)許多革蘭陽性細菌(如肺炎鏈球菌,S.pneumoniae)、陰性細菌(如鼠傷寒沙門,Salmonellatyphimurium)和真菌(白假絲酵母,Candida albicans)等如

2、果不能夠從外界攝取足夠的黃素(flavin)就需要自身合成核黃素(vitamin B12,riboflavin)以維持菌體的生存與增殖。DHBPs(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase),3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶,為核黃素生物合成關鍵酶之一。在鎂離子存在的情況下DHBPs將5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate,Ru5P)分解為3,4-二羥基-2-丁

3、酮-4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate,DHBP)和甲酸(formate)。生成的DHBP為核黃素合成的必需的原料之一。因此如果能夠抑制DHBPs的活性,就可能阻斷細菌的核黃素的合成,進而抑制細菌的生存和增殖。人類沒有合成核黃素的相關的酶而直接從食物中獲得以維持生存需要。因此細菌參與生物合成核黃素的相關酶就成為抗菌藥物作用的靶位點,其三維結構的獲得將有為設計開發(fā)新一代抗菌藥物提供重要的結構

4、模型[7,8]。因此DHBPs可望成為新一代抗生素作用的靶蛋白質。針對世界肺炎鏈球菌的耐藥越來越嚴重的問題,開發(fā)創(chuàng)新型基于結構的抗生素迫在眉睫。本課題通過對肺炎鏈球菌來源的DHBPs的結構的解析,目的是為潛在的新型抗生素或者疫苗提供理論依據(jù)。
　　 方法：克隆、表達、純化DHBPs蛋白質并利用汽相擴散法結晶獲得肺炎鏈球菌DHBPs的晶體,使用houseX射線光源(轉靶)收集分辨率較好的衍射數(shù)據(jù):以Protein Data Ban

5、k(PDB)中以Candida albicans的DHBPs(PDB code10.2210)的A鏈第1-200位氨基酸殘基作為模型,利用分子置換法(Molecular Replacement,MR)以獲得DHBPs晶體三維空間結構模型。
　　 結果：收到一套分辨率2.21-2.20(A)的數(shù)據(jù),用分子置換法解析出DJHBPs三維結構,并對其修正。修正后DHBPs的三維空間結構(Rfactor=5.5％,Rfree=34.5%,

6、PDBcode)。通過結構分析發(fā)現(xiàn):DHBPs與已知的其它物種來源的DHBPs分子結構相似,為進化上結構比較保守的蛋白質。
　　 結論：DHBPs在溶液中為二聚體形式和單體兩種形式存在,與晶體中兩個單體結合成二聚體的分子堆積方式是相符合的;通過蛋白質結構、序列分析發(fā)現(xiàn):底物作用位點位于DHBPs二聚體的結合位點,多個氨基酸參與,包括:Arg139、Thr143和His142等直接參與了與Ru5P的磷酸基團的結合;Glu30、As