EDHF-H2S、映山紅花總黃酮對大鼠海馬神經(jīng)元等超極化作用及其與KCa通道的關(guān)系研究.pdf

1、內(nèi)皮源性超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor, EDHF)是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和前列環(huán)素(prostacyclin, PGI2)外被發(fā)現(xiàn)的第三種由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的具有擴(kuò)血管作用的物質(zhì)。EDHF通過激活平滑肌細(xì)胞膜上的鈣離子激活鉀通道（Ca2+-sensitive K+ channel, KCa），誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞超極化從而引起血管舒張。本課題組前期研

2、究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦動脈血管 EDHF介導(dǎo)的舒張反應(yīng)是由硫化氫（hydrogen sulfide, H2S）引起的。
　　映山紅花總黃酮（total flavones of Rhododendra, TFR），系從映山紅花中提取的有效部位，其主要成分包括蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等黃酮類化合物。本課題組研究表明TFR可使腦血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）膜超極化，從而引起血管舒張，但未

3、見其對非興奮性細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞有無超極化作用。綜上本課題通過膜電位檢測和全細(xì)胞膜片鉗等技術(shù)，觀察EDHF/H2S對大鼠神經(jīng)元BKCa通道電流的影響及TFR的細(xì)胞膜超極化作用。
　　目的：
　　1.觀察H2S對大鼠海馬神經(jīng)元膜電位的影響；
　　2.觀察EDHF/H2S對大鼠海馬神經(jīng)元BKCa通道電流的影響；
　　3.觀察TFR對內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠神經(jīng)元細(xì)胞膜電位的影響。
　　方法：
　　1.常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培

4、養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞系；
　　2.原代培養(yǎng)24h內(nèi)新生 SD大鼠海馬神經(jīng)元,采用免疫熒光法鑒定大鼠海馬神經(jīng)元；
　　3.運(yùn)用 DiBAC4(3)熒光染料通過鈣離子成像系統(tǒng)在488nm激發(fā)波長下檢測內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠神經(jīng)元熒光強(qiáng)度以反映膜電位情況：（1）加入 NaHS（1×10-9~1×10-5 mol/L）和大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance Ca2+-sensitive K+channels，BKCa）通

5、道阻斷劑伊比利亞毒素（iberiotoxin，IbTX），記錄大鼠海馬神經(jīng)元膜電位；（2）加入 TFR（30、90、270、810 mg/L）、IbTX、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道（intermediae conductance Ca2+-sensitive K+ channels，IKCa）通道阻斷劑北非蝎毒素（charybdotoxin，ChTX）和小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small conductance Ca2+-sensitive K+

6、channels，SKCa）通道阻斷劑蜂毒明肽（apamin）、內(nèi)源性 H2S合成酶抑制劑 DL-炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine，PPG），記錄 EA.hy926細(xì)胞膜電位；（3）加入 TFR（30、90、270、810 mg/L）和IbTX，記錄大鼠海馬神經(jīng)元膜電位；
　　4.運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，（1）加入 EA.hy926細(xì)胞（endothelial cells，ECs）/大鼠腦動脈內(nèi)皮血管段（endo

7、thelium，Endo）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、NO和酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（N(G)-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）、環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（indomethacin，Indo）、IbTX、PPG，記錄內(nèi)源性 EDHF/H2S對大鼠海馬神經(jīng)元 BKCa通道電流；（2）加入NaHS（1×10-9-1×10-5 mol/L）和 IbTX，記錄外源性 EDHF/H2

8、S對大鼠海馬神經(jīng)元BKCa通道電流的影響。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光法鑒定，證實所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠海馬神經(jīng)元，且純度較高，雜細(xì)胞和組織塊較少。
　　2.1×10-6和1×10-5 mol/L的NaHS能顯著引起大鼠海馬神經(jīng)元膜超極化且IbTX能抑制1×10-6 mol/L NaHS引起的超極化效應(yīng)。
　　3.膜片鉗結(jié)果顯示（1）經(jīng)脈沖刺激的外向電流符合 BKCa通道電流特征，且IbTX能顯著抑

9、制此電流，證實所記錄的大部分電流為BKCa通道電流。（2）單獨(dú)加ECs/ Endo或ACh，均不能增大BKCa通道電流，但ECs/ Endo和ACh聯(lián)用電流卻顯著增大，且在加入 ECs/ Endo的基礎(chǔ)上，加入 L-NAME或/和Indo后給ACh，BKCa通道電流也能顯著增大，且IbTX和PPG能抑制這一電流增大效應(yīng)；（3）1×10-6和1×10-5 mol/L NaHS能顯著增大大鼠海馬神經(jīng)元BKCa通道電流，且IbTX能抑制這一電

10、流增大效應(yīng)。
　　4.270和810mg/L TFR能顯著引起 EA.hy926細(xì)胞膜超極化且 IbTX、ChTX和apamin聯(lián)用均能抑制270mg/L TFR引起的超極化效應(yīng)，而PPG不能抑制這一超極化效應(yīng)。
　　5.270和810mg/L TFR能顯著引起大鼠海馬神經(jīng)元膜超極化且 IbTX能抑制270mg/L TFR引起的超極化效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1. H2S能濃度依賴性地引起大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜超極化