映山紅花總黃酮抗心肌缺血損傷作用的H2S介導(dǎo)ROCK通路抑制機(jī)制.pdf

1、心肌缺血性疾病一直是威脅人類健康的主要疾病之一，缺血性心血管疾病，是世界范圍內(nèi)常見的死亡率和發(fā)病率較高的常見病。有關(guān)心肌缺血性損傷的病理機(jī)制及有效地預(yù)防和治療冠心病、心絞痛等心肌缺血性疾病的藥物研究是大家關(guān)注的重點(diǎn)研究課題之一。
　　映山紅花總黃酮（total flavones of rhododendra，TFR）系從映山紅花中提取的有效部位，其主要成分為槲皮素、金絲桃苷及蘆丁等黃酮類化合物，我們之前的研究表明映山紅花總黃酮對大

2、鼠和小鼠的心肌細(xì)胞缺氧性損傷有保護(hù)作用。然而，TFR的保護(hù)作用機(jī)制還不是很清楚，本研究的目的探討TFR對心肌缺氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制，重點(diǎn)研究TFR作用與Rho相關(guān)的卷曲螺旋激酶（Rhoassociated coiled coil-forming kinase，ROCK），鉀離子通道及H2S的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.觀察TFR對于心肌缺血、缺氧性損傷的保護(hù)作用；
　　2.探討TFR抗心肌缺血性損傷作用與ROCK的

3、關(guān)系，尤其是H2S介導(dǎo)的ROCK抑制與其抗損傷作用的關(guān)系；
　　3. TFR對心肌細(xì)胞鉀離子通道的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.冠狀動脈左前降支結(jié)扎致大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎30min后，再灌注90min，測定心電圖、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶（creatinine kinase，CK）活性的測定，觀察不同組心肌梗塞面積的比率，并進(jìn)行心肌

4、組織蘇木素-伊紅（HE)染色觀察病理學(xué)改變，使用western blot方法檢測其心肌組織中ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)。
　　2.新生乳鼠心肌細(xì)胞缺氧再給氧模型，檢測細(xì)胞活力，LDH活性和心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT)水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA)含量。使用Western blot檢測ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平。
　　3.皮下注射Iso致小鼠心肌缺血模型

5、，在CSE基因敲除小鼠及野生型小鼠上Sc Iso20mg/kg以制備心肌缺血損傷模型。觀察造模后1、2、5、15、20min各時(shí)間點(diǎn)的ECG，觀察ST段的變化，測定LDH、CK-MB等生化指標(biāo)，HE染色后檢查小鼠心肌病理改變，使用Western blot檢測心肌組織ROCK1，ROCK2和MLC1蛋白表達(dá)水平。
　　4.大鼠心肌細(xì)胞膜片鉗檢測，心肌細(xì)胞上的鉀離子通道的外向和內(nèi)向電流均被記錄。為減少細(xì)胞大小的誤差，采用電流密度進(jìn)行記

6、錄(pA/pF)。記錄心肌細(xì)胞上使用TFR、BaCl2、Apamin或IBTX前后細(xì)胞膜上電流的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.冠狀動脈左前降支結(jié)扎致大鼠心肌缺血再灌注損傷可致大鼠ECG的 ST段明顯抬高，再灌注30 min時(shí)尤為明顯，TFR（40、80 mg/kg）能顯著抑制缺血再灌注大鼠心電圖中ST段的抬高，ROCK抑制劑 Y27632也能抑制心肌缺血再灌注大鼠 ECG的 ST段的抬高。
　　2.缺血再灌注大鼠血清

7、中LDH活力和CK水平顯著上升，20、40、80 mg/kgTFR或Y276321mg/kg也能顯著抑制LDH和CK活性上升。
　　3. TFR20、40、80mg/kg可顯著減少I/R損傷引起心肌梗死面積百分比（IS/AAR），verapamil1.6 mg/kg和Y2763230 mg/kg同樣減少IS/ARR。
　　4.TFR40、80 mg/kg導(dǎo)致心肌細(xì)胞病理學(xué)變化。
　　5.I/R損傷引起ROCK1和ROC

8、K2蛋白表達(dá)增高。TFR20、40和80 mg/kg及ROCK通路阻斷劑Y2763230mg/kg顯著的抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)的升高。
　　6.TFR在3.7-300 mg/L的濃度范圍內(nèi)，可明顯抑制A/R引起的新生大鼠心肌細(xì)胞活力下降，減少LDH活力、cTnT水平和MDA含量。
　　7. A/R可明顯增加大鼠的新生乳鼠心肌細(xì)胞的ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平，TFR33.3、100和30

9、0 mg/L或者ROCK通路阻斷劑Y276321μmol/L顯著的抑制了ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)。
　　8.在大鼠的心肌細(xì)胞，加入選擇性內(nèi)向整流鉀離子通道阻斷劑BaCl2(100μM)，明顯抑制內(nèi)向鉀離子電流，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的內(nèi)向鉀離子通道由內(nèi)向整流鉀離子通道所介導(dǎo)；300 mg/L的TFR明顯增加內(nèi)向鉀離子電流，且能被BaCl2所阻斷，表明TFR能激活心肌細(xì)胞的內(nèi)向整流鉀通道；300 mg/L的TFR明顯增加外向鉀離子

10、電流，再加入Apamin(300 nmol/L)選擇性SKca通道阻斷劑，明顯抑制外向鉀離子電流，表明 TFR能激活心肌細(xì)胞的SKca通道；加入 BKca通道阻斷劑 IBTX（100 nmol/L）后，對電流沒有影響，說明心肌細(xì)胞上不存在BKca。
　　9.CSE基因敲除小鼠在給Sc Iso后，其心電圖ST段均有顯著抬高，且抬高程度較野生型更為明顯。KO小鼠TFR組和WT小鼠TFR組比較，抑制ST段的抬高的作用不明顯。
　　

11、10. CSE基因敲除小鼠Sc Iso可致WT小鼠血清中LDH水平和CK-MB活性顯著增高，且較野生型升高的更為明顯。KO小鼠TFR組和WT小鼠TFR組比較，抑制LDH和CK-MB水平升高的作用不明顯。
　　11. TFR可明顯改善WT小鼠心肌缺血引起的心肌細(xì)胞病理組織學(xué)改變，CSE KO小鼠正常組心肌細(xì)胞排列整齊，無變性壞死，無炎性細(xì)胞浸潤。KO模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯損傷，且損傷較野生型更為嚴(yán)重。
　　12. WT小

12、鼠Sc Iso導(dǎo)致的缺血后明顯的增加ROCK1，ROCK2和MLC1蛋白表達(dá)水平。TFR60 mg/kg顯著的抑制了ROCK1，ROCK2和MLC1蛋白的表達(dá)。CSE基因敲除小鼠缺血后ROCK1，ROCK2和MLC1蛋白表達(dá)水平比野生型明顯升高，但TFR對ROCK1，ROCK2和MLC1蛋白表達(dá)水平增高的抑制不明顯。
　　結(jié)論：
　　1. TFR對于心肌缺血缺氧性損傷具有保護(hù)作用；
　　2. H2S介導(dǎo)的ROCK通路的