H2S-EDHF及映山紅花總黃酮對大鼠大腦中動脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的影響.pdf

1、內(nèi)皮衍生超級化因子即EDHF（endothelium-derived hyperpolarizing factor），是繼一氧化氮（nitric oxide,NO）、前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)之后的第三種具有自體活性的舒血管物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在不同種屬、不同部位的血管上都存在EDHF現(xiàn)象，EDHF的化學(xué)本質(zhì)在不同的血管上存在差異，近幾年研究表明，在大鼠腦血管上也存在EDHF現(xiàn)象，并且其化學(xué)本質(zhì)被初步證實(shí)為H2S（hydr

2、ogen sulfide）。但對其舒張血管的分子機(jī)制尚不明確。映山紅花總黃酮（total flavones of rhododendra,TFR）具有很好的舒張腦血管，抗腦中風(fēng)作用，但其舒張腦血管平滑肌作用的機(jī)制尚不明確，其作用是否與H2S有關(guān)。本研究試圖通過膜片鉗等技術(shù)，分別觀察H2S及TFR對大鼠大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）平滑肌細(xì)胞BKCa通道的影響，探討了H2S和TFR舒張血管作用機(jī)制及兩者

3、可能的內(nèi)在關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.觀察外源性H2S對大鼠MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流和蛋白的影響，探討H2S舒張腦血管的電生理和分子機(jī)制，為H2S作為腦血管EDHF提供理論依據(jù)；
　　2.觀察TFR對大鼠MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流的影響，從電生理角度探討TFR的腦保護(hù)作用機(jī)制；
　　3.探討H2S和TFR對大鼠MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道影響的內(nèi)在可能聯(lián)系，進(jìn)一步研究TFR的舒血管作用和H2S/

4、EDHF的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.用酶解法急性分離大鼠MCA平滑肌細(xì)胞。
　　2.用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄大鼠MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流，并進(jìn)行如下分組檢測：
　?。?）選取適宜的平滑肌細(xì)胞，封接破膜，形成全細(xì)胞模式，向電極外液中依次加梯度濃度的NaHS，檢測外源性H2S對BKCa通道電流的影響。
　?。?）選取另一組適宜的平滑肌細(xì)胞，形成全細(xì)胞模式，向電極外液中依次加梯度濃度的TFR，檢測T

5、FR對BKCa通道電流的影響。
　?。?）選取另一組適宜的平滑肌細(xì)胞，形成全細(xì)胞模式，通過PPG作用，探討TFR對BKCa通道電流的影響與內(nèi)源性H2S的關(guān)系。
　　3.原代法培養(yǎng)大鼠MCA平滑肌細(xì)胞，并用免疫組化方法進(jìn)行鑒定。
　　4.用Western blot法測NaHS對大鼠MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道蛋白含量表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在急性分離的MCA平滑肌細(xì)胞上

6、能記錄到正常BKCa通道開放電流，并且此電流能被100 nmol/L濃度的BKCa通道特異性阻斷劑IBTX所抑制；
　　2.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梯度濃度的NaHS（10、100、500nmol/L）能激活MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道，且電流在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性的增加，此外NaHS對BKCa通道的激活作用能被IBTX特異性阻斷；
　　3.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梯度濃度的TFR（33.3，100，300 mg/L）

7、可顯著性增加MCA平滑肌細(xì)胞BKCa通道的電流（P0.001），100 nmol/L濃度的IBTX可以阻斷TFR引起的BKCa通道激活。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCA平滑肌細(xì)胞通過100?mol/L內(nèi)源性H2S合成酶抑制劑PPG作用后，TFR仍能引起B(yǎng)KCa通道的激活。
　　5.平滑肌細(xì)胞免疫組化鑒定結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)顯色后，細(xì)胞質(zhì)著色,高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)大量棕的纖維細(xì)絲,即平滑肌肌動蛋白絲。
　　6.wes