映山紅花總黃酮對(duì)腦缺血再灌大鼠腦血管舒張作用的EDHF-H2S機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.觀察乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)誘導(dǎo)的CIR大鼠CBA和MCA中EDHF與NO介導(dǎo)的血管舒張功能的變化;
　　2.觀察TFR對(duì)CIR大鼠MCA的舒張作用及EDHF/H2S機(jī)制;
　　3.探討TFR對(duì)CIR大鼠MCA平滑肌細(xì)胞鈣激活鉀通道的影響;
　　4.研究TFR對(duì)CIR大鼠腦組織 H2S含量的影響。
　　方法:
　　1.采用改良的Pulsinelli-Brierl

2、ey四血管阻斷法(four-vessel occlusion,4-VO)建立大鼠全腦缺血再灌模型。
　　2.采用動(dòng)脈加壓灌注法測(cè)定離體腦血管舒縮功能。觀察ACh對(duì)CIR大鼠CBA和MCA的舒張作用,及在NO合酶(NOS)抑制劑N-nitro-L-arginine-methyl-ester存在時(shí)或 L-NAME和PGI2合成酶抑制劑indomethacin共同存在時(shí),ACh對(duì)血管的舒張效應(yīng)的變化;觀察內(nèi)源性H2S合酶CSE的底物L(fēng)-

3、半胱氨酸及H2S供體硫氫化鈉對(duì)CIR大鼠MCA的血管舒張作用;觀察TFR對(duì)CIR大鼠MCA的舒張作用,合用PGI2合成酶抑制劑Indo和NOS抑制劑L-NAME對(duì)TFR血管舒張反應(yīng)的影響;鈣激活性鉀通道(KCa)阻斷劑tetraethylammonium或內(nèi)源性H2S合酶抑制劑DL-propargylglycine(PPG, DL-炔丙基甘氨酸)對(duì)TFR引起的非NO、非PGI2舒張作用的影響。
　　3.采用細(xì)胞膜電位記錄法,觀察A

4、Ch對(duì)CIR大鼠CBA、MCA平滑肌細(xì)胞的超極化作用,合用L-NAME和Indo對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)超極化作用的影響;觀察L-Cys及NaHS對(duì)CIR大鼠MCA血管平滑肌細(xì)胞的超極化作用;觀察不同濃度TFR對(duì)CIR大鼠MCA平滑肌細(xì)胞超極化作用的影響,合用L-NAME與Indo對(duì)TFR超極化作用的影響;研究PPG或KCa阻滯劑TEA對(duì)TFR誘導(dǎo)的非NO、非PGI2血管平滑肌細(xì)胞的超極化作用的影響。
　　4.運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗

5、法,記錄不同濃度TFR對(duì)急性消化分離 CIR大鼠 MCA平滑肌細(xì)胞鈣激活的鉀電流的影響及 KCa阻斷劑 TEA對(duì)其作用的影響。
　　5.運(yùn)用免疫磁珠分離法分離純化大鼠MCAs內(nèi)皮細(xì)胞,采用RT-PCR技術(shù)半定量檢測(cè)CIR大鼠MCAs內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性 H2S合酶—CSEmRNA的表達(dá);研究分析 TFR對(duì) CIR大鼠 MCA舒張作用與CSEmRNA表達(dá)的關(guān)系以及PPG對(duì)TFR的影響。
　　6.采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定CIR大鼠腦組織

6、H2S的含量以及TFR對(duì)其的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在離體血管舒縮功能測(cè)定中,在30mmol/LKCl預(yù)收縮的大鼠CBA血管環(huán)上,用L-NAME預(yù)處理后,ACh對(duì)全腦缺血再灌組(Model組)與假手術(shù)組(Sham組)的CBA均產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用,其中Model組CBA最大舒張率為61.8±5.3％,與Sham組50.3±6.1%比較,差異有顯著性(P<0.01);當(dāng)合用L-NAME和Indo預(yù)灌后,ACh仍可誘導(dǎo)M

7、odel組和Sham組CBA產(chǎn)生舒張反應(yīng),并且Model組對(duì)CIR大鼠CBA舒張反應(yīng)顯著高于Sham組,差異明顯(P<0.01)。而加入PPG后,ACh對(duì)CIR大鼠CBA誘導(dǎo)的這種非NO、非PGI2作用被顯著抑制。
　　2.在離體大鼠MCA血管環(huán)上,用L-NAME預(yù)灌后,ACh對(duì)KCl)預(yù)收縮的大鼠MCA仍能引發(fā)血管松弛反應(yīng),Model組與Sham組MCA最大舒張率分別為61.4±5.9%和53.0±4.0%,兩者比較,差異有顯著

8、性( P<0.01);而合用Indo和L-NAME預(yù)處理后,ACh仍可介導(dǎo)兩組MCA產(chǎn)生舒張反應(yīng),其中Model組最大舒張率為59.6±5.5%,明顯高于Sham組49.6±4.8%,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);且Model組MCA上的這種非NO、非PGI2效應(yīng)能被PPG明顯抑制。
　　3.在細(xì)胞內(nèi)記錄膜電位實(shí)驗(yàn)中,合用L-NAME和Indo預(yù)灌大鼠CBA后,ACh能產(chǎn)生濃度依賴性的非NO、非PGI2平滑肌細(xì)胞膜靜息電位

9、超極化作用,與Sham組-8.2±0.9mV相比,Model組CBA平滑肌細(xì)胞的最大超極化幅度為-10.1±1.3mV,絕對(duì)值明顯加大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);加入PPG后,ACh對(duì)Model組CBA平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)的這種非NO、非PGI2效應(yīng)幾乎完全消失。
　　4.在L-NAME與Indo同時(shí)存在時(shí),ACh能誘導(dǎo)大鼠 MCA產(chǎn)生濃度依賴性的非 NO、非 PGI2平滑肌細(xì)胞膜靜息電位超極化作用,Sham組與Model組MC

10、A的最大超極化幅度分別為-10.7±0.8 mV和-12.5±1.2mV,兩者比較,差異明顯(P<0.05);而PPG能顯著取消ACh對(duì)Model組MCA平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)的這種非NO、非PGI2反應(yīng)。
　　5.在運(yùn)用NOS抑制劑L-NAME和PGI2合成酶抑制劑Indo,排除NO、PGI2作用后,內(nèi)源性H2S合酶(CSE)的底物L(fēng)-Cys仍能引起CIR大鼠MCA產(chǎn)生顯著的濃度依賴性舒張作用和VSMC膜電位的超極化作用。而應(yīng)用CSE阻

11、滯劑PPG預(yù)處理后,能顯著減弱L-Cys產(chǎn)生的非NO非PGI2效應(yīng),其最大舒張率由57.0±4.3%降至8.7±2.3%,最大超極化幅度由-10.2±1.1mV降至-1.8±0.3mV(P<0.01, vs L-Cys+L-NAME+Indo)。
　　6.在離體血管舒縮功能測(cè)定和細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),合用L-NAME與Indo預(yù)處理后,外源性H2S供體NaHS能誘導(dǎo)CIR大鼠MCA產(chǎn)生濃度依賴性的非NO非PGI2血管舒張作用和

12、VSMC膜電位的超極化作用,其最大舒張率和最大超極化幅度分別為60.4±4.1%、-12.5±1.5mV。而鈣激活的鉀通道阻滯劑TEA可明顯抑制NaHS對(duì)CIR大鼠MCA的這種非NO非PGI2效應(yīng)。
　　7.在離體血管舒縮功能測(cè)定中,應(yīng)用L-NAME和Indo預(yù)灌大鼠MCA后,在300~2700mg/L范圍內(nèi)的TFR對(duì)30mmol/L KCl預(yù)收縮的大鼠 MCA可產(chǎn)生濃度依賴性的非 NO、非 PGI2介導(dǎo)的舒張作用,其KCa阻滯劑

13、TEA后,TFR誘導(dǎo)CIR大鼠MCA產(chǎn)生的非NO非PGI2介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)被取消,其最大舒張率降至5.7±1.2%( P<0.01,vs TFR+L-NAME+Indo)。同樣,在應(yīng)用內(nèi)源性H2S合酶阻滯劑PPG后,PPG也顯著抑制TFR對(duì)CIR大鼠MCA引起的非NO、非PGI2的血管舒張反應(yīng)。
　　8.在細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn)中,TFR能誘導(dǎo)CIR大鼠MCA平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的濃度依賴性的非NO非PGI2的超極化反應(yīng),其最大超極化

14、幅度可達(dá)-15.8±1.9mV,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, vs Vehicle)。而KCa阻滯劑TEA可取消TFR誘導(dǎo)CIR大鼠MCA產(chǎn)生的這種超極化作用,使其最大超極化幅度降至-0.9±0.2mV,與未用TEA組比較,差異顯著(P<0.01)。PPG也能明顯取消TFR誘導(dǎo)產(chǎn)生的非NO、非PGI2超極化作用。
　　9.在全細(xì)胞膜片鉗記錄VSMC鈣激活性鉀電流實(shí)驗(yàn)中,TFR能促使急性分離的CIR大鼠MCA平滑肌細(xì)胞的外向

15、電流密度呈濃度依賴性的增強(qiáng)(P<0.05, P<0.01, vs Control)。而此效應(yīng)可以被1mmol/L鈣激活的鉀通道(KCa)抑制劑TEA所阻斷。
　　10.采用免疫磁珠分選法分離純化得到大鼠MCAs內(nèi)皮細(xì)胞,在RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)CIR大鼠MCAs內(nèi)皮細(xì)胞上有內(nèi)源性H2S合酶—CSEmRNA條帶的表達(dá);與Sham組相比,Model組內(nèi)皮細(xì)胞CSEmRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01);與NS組比較,TFR(5

16、0、100mg/kg)的CSEmRNA斑帶亮度明顯增加(P<0.01),而CSE阻斷劑PPG能顯著抑制TFR上調(diào)的CSEmRNA表達(dá)水平(P<0.01)。
　　11.大鼠腦皮質(zhì)H2S含量檢測(cè)結(jié)果表明Model組大鼠腦組織H2S含量有明顯升高(P<0.01,vsSham),TFR預(yù)處理可進(jìn)一步提高CIR大鼠腦組織H2S含量(P<0.05,P<0.01,vsNS)。
　　結(jié)論:
　　1.在CIR大鼠CBA和MCA中,EDH

17、F功能是上調(diào)的,NO功能是下調(diào)的,并且此EDHF反應(yīng)可能是由H2S介導(dǎo)的;
　　2. TFR能誘導(dǎo)CIR大鼠MCA產(chǎn)生濃度依賴性的非NO非PGI2的血管舒張作用和VSMC超極化反應(yīng);
　　3. TFR對(duì)CIR大鼠MCA產(chǎn)生的非NO非PGI2反應(yīng)與KCa通道開放有關(guān),提示這種非NO非PGI2樣的效應(yīng)可能為EDHF效應(yīng);
　　4. TFR誘導(dǎo)的CIR大鼠MCA的EDHF反應(yīng)與內(nèi)源性H2S有關(guān);
　　5. TFR對(duì)CI