溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）胞外產(chǎn)物（ECP）的理化特性及其致病機(jī)理的研究.pdf

1、本文研究了幾種培養(yǎng)條件對溶藻弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)產(chǎn)量的影響、ECP的理化和生物學(xué)特性及其致病機(jī)理。 結(jié)果表明，培養(yǎng)條件對溶藻弧菌ECP的產(chǎn)量有重要影響，用胰胨豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA＋2％NaCl）培養(yǎng)48h ECP蛋白產(chǎn)量達(dá)到最高，酶活性較強(qiáng)。溶藻弧菌用TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，用PBS洗下培養(yǎng)物，離心后上清用0.22 μm的微孔慮膜過濾，制備了溶藻弧菌ECP粗提液。經(jīng)檢測，該ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等多種

2、酶活性，對青鱸、美國紅魚和赤點(diǎn)石斑魚等海水魚類的紅細(xì)胞有一定的溶解能力，溶血價(jià)分別為25、23和21。ECP對小白鼠和石斑魚的LD50分別為0.08 mg/g和0.17 mg/g。將偶氮酪蛋白摻入丙烯酰胺聚合后，加ECP作SDS－PAGE，37℃原位消化，染色，有四條比較明顯的透明蛋白帶，顯示出ECP中存在四種不同分子量大小的蛋白酶；此外，用脫脂奶瓊脂平板法和偶氮酪蛋白（Azocasein）底物法也均能檢測到胞外產(chǎn)物中蛋白酶的存在。經(jīng)L

3、aemmli不連續(xù)SDS－PAGE凝膠電泳，該ECP至少有10種蛋白成分，有四條清晰蛋白帶，分子量在29KD～66KD之間,其中一條帶的分子量約為33KD。ECP與乙二胺四乙酸（EDTA）或者絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）作用，其胞外蛋白酶（ECPase）的活力有不同程度的下降,分別為83.40％和51.32％。該酶對熱不穩(wěn)定，在pH 6.0到10.6之間顯示出較高酶活性，它的最適pH為8.0,最適溫度為50℃，37℃下最適

4、作用時(shí)間為70 min。粗提ECP經(jīng)硫酸銨鹽析，DEAE-纖維素層析和Sephadex G-100分子篩層析分離純化了幾種胞外蛋白，酶活性存在于第一洗脫峰。 用ECP注射石斑魚后，分析了紅細(xì)胞（RBC）的數(shù)量、白細(xì)胞（WBC）的數(shù)量、紅細(xì)胞及其核的大小、血紅蛋白（Hb）含量、滲透脆性、白細(xì)胞（WBC）的分類和比率、血清無機(jī)離子濃度以及幾種酶的含量等。血液病理學(xué)測定結(jié)果表明：在紅細(xì)胞中，注射組和對照組的紅細(xì)胞數(shù)分別為1.60百萬/

5、mm3和3.30百萬/mm3，血紅蛋白值分別為5.17g/100mL和7.46g/100mL，紅細(xì)胞滲透脆性分別為0.54﹪和0.32﹪；在白細(xì)胞中，注射組和對照組的白細(xì)胞數(shù)分別為34.00萬/mm3 和20.38萬/mm3，嗜中性粒細(xì)胞比率分別為29.40﹪和61.60﹪，淋巴細(xì)胞比率分別為70.20﹪和37.90﹪，單核細(xì)胞比率分別為1.40﹪和0.90﹪。注射ECP后的石斑魚與對照組石斑魚相比，紅細(xì)胞血紅蛋白值（Hb）降低，紅細(xì)胞

6、數(shù)量減少，白細(xì)胞數(shù)量增加，紅細(xì)胞滲透脆性增加，白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞比率降低，淋巴細(xì)胞比率明顯升高，表明注射組石斑魚有貧血傾向和其它相應(yīng)的病理變化，并且發(fā)現(xiàn)血涂片中注射組魚的紅細(xì)胞容易破裂，對照組魚的血涂片上可以看見成群出現(xiàn)的血小板，而在注射組魚的血涂片上幾乎見不到此種現(xiàn)象，血小板數(shù)量明顯減少且不成群出現(xiàn)。在血清生化指標(biāo)中，注射組和對照組的K+濃度分別為274.04μg/mL和262.77μg/mL，Na+濃度分別為2832.78μg/m

7、L和3264.00μg/mL，Ca2+濃度分別為136.59μg/mL和142.42μg/mL，Mg2+濃度分別為41.46μg/mL和34.84μg/mL，尿素氮濃度分別為1.75mmol/L和1.31mmol/L，葡萄糖濃度分別為0.58mmol/L和0.98mmol/L，總蛋白含量分別為44.00g/L和48.60g/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶分別為463.40IU/L和88.80IU/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶分別為209.00IU/L和80.00IU

8、/L，乳酸脫氫酶分別為1144.20IU/L和372.80IU/L，磷酸肌酸激酶分別為10421.80IU/L和1854.00IU/L。對所得結(jié)果用t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明注射組和對照組石斑魚在這些指標(biāo)上多存在顯著差異，可認(rèn)為溶藻弧菌ECP在溶藻弧菌對石斑魚的致病中發(fā)揮了重要作用。 注射ECP的石斑魚48h后開始出現(xiàn)死亡，注射后表現(xiàn)出一系列臨床癥狀：平衡能力低，運(yùn)動遲緩，體色變深，注射部位出現(xiàn)紅腫，結(jié)痂，腹部膨大，打開腹

9、腔可見明顯的積水，肝臟出血有花斑，腎臟和脾臟腫大，腸道內(nèi)無食物。取剛剛死亡或者瀕臨死亡石斑魚的肝臟、腎臟、脾臟、腸、鰓、心肌等組織制備病理組織切片，顯微觀察發(fā)現(xiàn)這些組織均發(fā)生較病變，其中尤以腎臟和脾臟病變最為明顯。部分肝細(xì)胞壞死，解體，肝臟出血，肝索中有紅細(xì)胞浸潤，肝組織中巨噬細(xì)胞增多；脾臟中細(xì)胞結(jié)構(gòu)不明顯，細(xì)胞壞死，小動脈擴(kuò)張；腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死，嚴(yán)重者甚至整個(gè)上皮細(xì)胞層脫落下來；腸內(nèi)沒有食物，腸粘膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，微絨毛模