CTLA4Ig及整合素α4β7基因重組腺病毒修飾樹突狀細(xì)胞.pdf

1、第一部分整合素α4β7基因重組、克隆 目的：從小鼠小腸peyer結(jié)中克隆小鼠整合素α4、p7基因，為下一步利用腺病毒載體AdEasy system構(gòu)建Adα4β7打下基礎(chǔ)。 方法：以小鼠小腸PP提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增小鼠整合素α4、β7基因的特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用膠回收法純化目的基因α4、β7，目的基因定向克隆至載體pMD-18．pMD-19，構(gòu)建質(zhì)粒pMD-18-α4、pMD-19-β7，進(jìn)

2、行測序，與己知GenBank中的α4、β7基因進(jìn)行序列比較，對導(dǎo)致編碼氨基酸改變的突變堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變修復(fù)。 結(jié)果：克隆α4、β7基因，序列測定表明α4基因序列有6個(gè)堿基突變導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，β7基因序列有5個(gè)堿基突變導(dǎo)致編碼氨基酸的改變。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對造成編碼氨基酸的堿基定點(diǎn)突變修復(fù)。 結(jié)論：本研究成功克隆小鼠α4、β7基因，確定對造成編碼氨基酸改變的突變堿基定點(diǎn)突變修復(fù)。 第二部分構(gòu)建重組腺病毒AdC

3、TLA4Ig、 Adα4β7 目的：應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)AdEasy System構(gòu)建含有CTLA4Ig、α4β7基因的重組腺病毒AdCTLA4Ig、Adα4β7及其對照腺病毒AdGFP，從pIRES<,2>-EGFP克隆IRES序列用于將α4、β7基因連接并插入同一基因表達(dá)盒，為進(jìn)一步應(yīng)用其進(jìn)行誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫耐受、定植到腸道淋巴組織研究打下基礎(chǔ)。 方法：1、將目的基因CTLA4Ig克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CM

4、V，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdCTLA4Ig；將穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV直接酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdGFP，將重組腺病毒質(zhì)粒pAdCTLA4Ig、pAdGFP以酶切法及PCR法進(jìn)行鑒定。重組腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，于熒光顯微鏡下

5、觀察綠色熒光以確定轉(zhuǎn)染效果。2、將目的基因α4、β7基因、IRES序列分別克隆至穿梭質(zhì)粒pAdshuttle-CMV，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒。將重組腺病毒質(zhì)粒以酶切法及PCR法進(jìn)行鑒定。重組腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用PCR法鑒定構(gòu)建效果，用Western Blot法確定目的基因表達(dá)。 結(jié)果：1、重組腺病毒質(zhì)粒pA

6、dCTLA4Ig、pAdGFP經(jīng)Pac Ⅰ酶切后可見4.5kb和一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后于熒光顯微鏡下可觀察到明亮的綠色熒光。將收集的病毒液做PCR鑒定，結(jié)果表明重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdGFP構(gòu)建成功。2、重組腺病毒質(zhì)粒pAdα4β7經(jīng)Pac Ⅰ酶切后可見4.5kb和一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，將收集的病毒液做PCR鑒

7、定，結(jié)果表明重組腺病毒Adα4β7構(gòu)建成功，Western Blot法檢測表明有目的基因α4β7表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組腺病毒AdCTLA4Ig、Adα4β7及對照腺病毒AdGFP。 第三部分腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CTLA4Ig、α4β7基因修飾樹突狀細(xì)胞及功能檢測 目的：從小鼠骨髓分離培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，建立體外原代培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的方法，確定影響樹突狀細(xì)胞成熟的因素和CTLA4Ig、α4β7表達(dá)效率，構(gòu)建穩(wěn)定編碼CTLA4

8、Ig和α4β7腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞疫苗。 方法：從小鼠脛骨和股骨沖洗出骨髓，制成細(xì)胞懸液，在GM-CSF和IL-4作用下，體外培養(yǎng)7天。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表型，確定為樹突狀細(xì)胞后，感染重組腺病毒并與OVA共育。FACS鑒定細(xì)胞成熟狀態(tài)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)和細(xì)胞生存狀態(tài)，Wesern Blot法測定目的基因表達(dá)，激光共聚焦檢測CTLA4Ig和α4β7兩種蛋白分

9、子在同一細(xì)胞的表達(dá)情況；樹突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，MTT法檢測T淋巴細(xì)胞增殖，TUNEL 法檢測T淋巴細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：50％左右樹突狀細(xì)胞具有CD11c表型，確定為樹突狀細(xì)胞。CTILA4Ig蛋白位置接近53kDa的蛋白條帶，α4β7蛋白分子位置接近198kDa的蛋白條帶。50％左右細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CTLA4Ig和α4β7兩種蛋白分子。CTLA4Ig和α4β7基因表達(dá)的樹突狀細(xì)胞明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。

10、 結(jié)論：腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CTLA4Ig和α4β7修飾樹突狀細(xì)胞可使樹突狀細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CTLA4Ig和α4β7兩種蛋白分子，共刺激分子CD86和CD80減少，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。 本研究創(chuàng)新性在于： 1．本研究首次將CTLA4Ig基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)DC用于食物過敏的治療，也是國內(nèi)首次將基因治療用于食物過敏治療： 2．本研究于國內(nèi)首次將小鼠整合素α4、β7兩個(gè)基因全長完整克隆，并對導(dǎo)致氨基