乙肝表面抗原抑制外周血漿樣樹突狀細(xì)胞干擾素—α分泌的機(jī)制研究.pdf

1、由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎(簡(jiǎn)稱“乙肝”)是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。全球約有三億五千萬乙肝患者及無癥狀攜帶者，其中近一半在中國。大部分新生兒以及約5％左右的成年人感染HBV后不能及時(shí)清除病毒而發(fā)展為慢性肝炎。HBV慢性持續(xù)性感染與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　目前研究認(rèn)為免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的宿主與病毒的相互作用決定著HBV感染后病毒的清除和肝炎病變的進(jìn)程。IFN-α(Int

2、erferon-α)能夠誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白表達(dá)，并且能夠激活先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng)，是目前臨床上治療慢性乙肝(CHB)感染的一線藥物，并取得相對(duì)較好的治療效果。宿主體內(nèi)外周血干擾素-α主要由外周血中的漿樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)產(chǎn)生，因此，pDCs及其分泌的干擾素在宿主抗病毒過程中扮演重要角色。
　　有大量研究表明慢性乙肝患者外周血中pDCs數(shù)量下降且功能受損，且CHB患者經(jīng)拉米夫定抗病毒治療，病毒載量降到檢測(cè)

3、水平以下時(shí)，pDCs的數(shù)量出現(xiàn)回復(fù)性升高，提示HBV可能影響了pDCs的數(shù)量和功能，并推測(cè)這可能是HBV導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染的原因之一。目前pDCs受HBV影響的具體機(jī)制還不清楚，本課題擬對(duì)此作進(jìn)一步探索。
　　首先證實(shí)慢性乙肝患者PBMCs用Toll樣受體9(TLR9)的配體CpG A刺激后，其產(chǎn)生IFN-α的能力與正常人相比明顯減弱，結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的CHB病人外周血中pDCs功能受損一致。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在

4、患者肝臟以及血液中大量存在，推測(cè)其可能在HBV感染慢性化過程中扮演了重要的角色。
　　為明確HBsAg參與影響了外周血免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的功能，在體外實(shí)驗(yàn)中用自病人血漿純化的HBsAg預(yù)處理正常人的PBMCs，再經(jīng)TLR7配體Gardiquimod或TLR9配體CpG A刺激，發(fā)現(xiàn)PBMCs產(chǎn)生IFN-α的能力較未作HBsAg預(yù)處理時(shí)明顯降低，推測(cè)HBsAg抑制了PBMCs中pDCs分泌IFN-α的能力。然而當(dāng)用HBsAg預(yù)處理自

5、正常人純化的pDCs，發(fā)現(xiàn)HBsAg并不能抑制TLR7和TLR9介導(dǎo)的IFN-α的產(chǎn)生。上述結(jié)果表明HBsAg可能通過PBMCs中的某些細(xì)胞或細(xì)胞因子作用于pDCs，從而間接抑制了IFN-α的分泌。
　　為證實(shí)上述假設(shè)，本研究進(jìn)一步探討了HBsAg間接抑制pDCs IFN-α產(chǎn)生的可能途徑。鑒于單核細(xì)胞在外周血中占有較高比例并為重要的抗原提呈細(xì)胞，磁珠分選單核細(xì)胞和pDCs，將單核細(xì)胞與pDCs以一定比例共孵育，經(jīng)HBsAg預(yù)處理

6、及CpG A刺激，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞能夠明顯加強(qiáng)HBsAg對(duì)pDCs IFN-α產(chǎn)生的抑制作用，且隨著單核細(xì)胞數(shù)量的增加，HBsAg抑制IFN-α產(chǎn)生的現(xiàn)象也更加明顯。此外，HBsAg基本不能抑制剔除單核細(xì)胞的PBMCs中IFN-α產(chǎn)生的作用，提示單核細(xì)胞在HSsAg抑制pDCs IFN-α分泌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步明確單核細(xì)胞對(duì)pDCs的作用途徑是通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸作用或是通過分泌細(xì)胞因子間接作用，采用transwell小室將

7、單核細(xì)胞和pDCs分隔開，重復(fù)HBsAg處理及CpG A刺激后pDCs IFN-α的分泌情況。結(jié)果顯示單核細(xì)胞和pDCs分隔開后，HBsAg仍然能夠明顯抑制pDCs中IFN-α產(chǎn)生，提示單核細(xì)胞通過分泌某些細(xì)胞因子來影響間接影響pDCs的功能。
　　鑒于TFN-α(Tumor necrosis factor-α)和IL-10(Interleukin-10)為單核細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，且已有報(bào)道TFN-α和IL-10能夠抑制pDC

8、s IFN-α產(chǎn)生，檢測(cè)了存在HBsAg抑制IFN-α產(chǎn)生現(xiàn)象的pDCs和單核細(xì)胞共孵育體系、PBMCs以及不存在抑制現(xiàn)象的pDCs上清中TNF-α、IL-10的分泌情況，結(jié)果顯示經(jīng)HBsAg預(yù)處理的PBMCs及pDCs和單核細(xì)胞共孵育組中TNF-α的分泌顯著升高，單純pDCs組并未見顯著升高。而在體外用HBsAg處理純化的單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HBsAg能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10。同時(shí)，在剔除單核細(xì)胞的PBMC

9、s中，HBsAg則基本不能誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步確認(rèn)TNF-α和IL-10主要是由單核細(xì)胞所分泌。為確認(rèn)TNF-α和IL-10對(duì)pDC功能的抑制作用，在體外向PBMCs中外源性添加TNF-α、IL-10，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞因子能夠不同程度地抑制PBMCs和pDCs IFN-α產(chǎn)生。進(jìn)一步的細(xì)胞因子中和抗體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TNF-α和IL-10的中和抗體預(yù)處理后，HBsAg對(duì)于IFN-α產(chǎn)生的抑制作用明顯減弱。上述結(jié)果證實(shí)由單核細(xì)胞分泌

10、的TNF-α和IL-10在介導(dǎo)HBsAg抑制pDCs產(chǎn)生IFN-α中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　為了解釋TNF-α和IL-10對(duì)pDCs分泌IFN-α功能的抑制作用，初步探討了TNF-α和IL-10對(duì)pDCs中TLR9介導(dǎo)IFN-α生成信號(hào)通路的影響。研究結(jié)果顯示，TNF-α和IL-10可下調(diào)pDCs中TLR9受體的表達(dá)，推測(cè)可能是TNF-α和IL-10抑制IFN-α產(chǎn)生的機(jī)制之一。
　　綜上所述，本研究證實(shí)乙肝表面抗原可以抑制外