基于Fosmid文庫(kù)和PCR篩選技術(shù)的蜘蛛包卵絲蛋白基因克隆及分析.pdf

1、蜘蛛絲具有多樣的分子結(jié)構(gòu)及生物生態(tài)學(xué)功能，同時(shí)還具有強(qiáng)度高、彈性好、初始模量大、斷裂能大、可生物降解、生物相容性好、保濕性好、輕盈等其它合成高性能纖維所無法比擬的優(yōu)良機(jī)械性能及特性，因而，在紡織、航天航空、生物醫(yī)學(xué)以及軍事等領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用前景。
　　 然而，蜘蛛具有種內(nèi)殘食性且蛛絲產(chǎn)量較低，因而，采用大規(guī)模飼養(yǎng)蜘蛛以獲取蛛絲的方法是不可取的，目前以基因工程的方法獲取蛛絲蛋白是首選策略。研究表明包卵絲的韌性極其優(yōu)越，因此，

2、本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大腹園蛛基因組Fosmid文庫(kù)以釣取包卵絲蛋白全長(zhǎng)編碼基因，從而為后續(xù)仿生蛛絲的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 包卵絲蛋白主要分為葡萄狀絲蛋白和管狀腺絲蛋白，本實(shí)驗(yàn)主要圍繞這兩種蛋白開展研究：
　　 1.成功分離葡萄狀腺體及管狀腺體并獲取其高質(zhì)量總RNA，并通過巢式PCR技術(shù)獲取悅目金蛛葡萄狀腺絲和管狀腺絲部分cDNA序列，并對(duì)其的分子機(jī)制進(jìn)行了探索與討論，初步闡釋了包卵絲蛋白的結(jié)構(gòu)模式和進(jìn)化演變，為包卵絲全長(zhǎng)基因的

3、克隆及仿生研究提供了前期研究基礎(chǔ)：
　　 2.通過3’-RACE的方法成功獲取大腹園蛛葡萄狀絲CTR序列及兩個(gè)完整的重復(fù)單元，為AcSpl編碼基因的結(jié)構(gòu)解析提供了參考，并為進(jìn)一步研究蛛絲蛋白基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及人工仿生蜘蛛絲奠定了理論基礎(chǔ)：
　　 3.建立了適于提取大腹園蛛HMW-gDNA的方法-改進(jìn)的CTAB法，并在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了無偏向性的A.ventricosus Fosmid基因組文庫(kù)，對(duì)30～40 Kb的外源片段

4、經(jīng)過補(bǔ)平磷酸化、連入pCC2FOSTM載體、lambda噬菌體包裝蛋白進(jìn)行體外包裝、轉(zhuǎn)染EPI300TM-T1R E.coli，成功共構(gòu)建了A.ventricosus Fosmid基因組文庫(kù)。5次包裝滴定度處于6.0×104～1.1×105之間，共產(chǎn)生約2.99×105個(gè)文庫(kù)克隆，覆蓋A.ventricosus全基因組約5倍；
　　 4.建立了基因組文庫(kù)的PCR逐級(jí)篩選系統(tǒng)：該方法基于384-well plate構(gòu)建Fosmid

5、基因組文庫(kù)的板混合池、行混合池和列混合池，利用特異性引物對(duì)混合池進(jìn)行篩選以確定陽(yáng)性克隆的精確位置，該方法既保留了常規(guī)PCR文庫(kù)篩選方法的簡(jiǎn)捷經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，又彌補(bǔ)了篩選周期長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。
　　 通過本實(shí)驗(yàn)研究，成功獲取了悅目金蛛(Argiope amoena)和大腹園蛛(Araneus ventricosus)包卵絲蛋白編碼基因，并成功構(gòu)建了大腹園蛛基因組Fosmid文庫(kù)并建立適于基因組文庫(kù)的PCR逐級(jí)篩選系統(tǒng)，為后續(xù)的篩選工