轉蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體綿羊成纖維細胞株的篩選.pdf

1、目前已知最為堅韌且有彈性的天然動物纖維之一——蜘蛛絲具有其它天然和人工材料無法比擬的超強剛性和出色的彈性。但由于蜘蛛無法高密度集群飼養(yǎng)而使得該方法無法大量獲得蜘蛛絲。因此，本研究根據綿羊自身產生毛發(fā)角蛋白的特性，將人工合成的蜘蛛絲蛋白基因四聚體與綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子相連構建載體并轉染綿羊皮膚成纖維細胞，通過G418篩選含有neo抗性基因的陽性細胞，獲得轉拖絲蛋白基因四聚體細胞株。為建立轉基因細胞系，并通過體細胞核移植進一步產生轉蜘蛛拖絲

2、蛋白基因的克隆羊研究打下堅實基礎。研究結果與結論如下：
　　1、綿羊角蛋白基因啟動子的克隆:參照GenBank中啟動子序列，采用PCR擴增技術，依次克隆到中間絲角蛋白基因啟動子(K2.10)、高甘氨酸/酪氨酸蛋白基因啟動子(KAP6.1)和高硫角蛋白基因啟動子（B2A和B2C）;
　　2、綿羊角蛋白基因啟動子的表達活性:將上述啟動子與GFP報告基因連接，轉染綿羊成纖維細胞。結果表明:中間絲角蛋白K2.10基因啟動子、高甘氨酸

3、/酪氨酸角蛋白KAP6.1基因啟動子及高硫角蛋白B2C基因啟動子的重組質粒轉染后，檢測到綠色熒光蛋白的表達，而高硫角蛋白B2A基因啟動子未檢測到GFP熒光。選擇K2.10用于真核表達載體的構建;
　　3、綿羊角蛋白基因啟動子真核表達載體的構建:將K2.10啟動子與去除自身的CMV病毒啟動子的pcDNA3.1載體連接，獲得具有綿羊角蛋白基因啟動子的真核表達載體;
　　4、拖絲蛋白基因真核表達載體的構建:將四聚化絲蛋白基因與綿羊

4、角蛋白基因啟動子真核表達載體相連接，通過特異性引物將四聚體絲蛋白及角蛋白啟動子K2.10部分擴增后連接到去除自身CMV病毒啟動子的pIRES2-EGFP載體上，獲得拖絲蛋白基因真核表達載體，并對其線性化;
　　5、成纖維細胞的轉染與篩選:采用陽離子脂質體法轉染線性化的拖絲蛋白基因真核表達載體于原代培養(yǎng)的綿羊皮膚成纖維細胞中，利用G418篩選獲得neo基因的抗性細胞;
　　6、對neo基因抗性細胞的鑒定:對G418篩選獲得的抗