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文檔簡介
1、動脈粥樣硬化性疾病嚴重危害人類健康。泡沫細胞的形成在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著至關重要的作用。所以,有效的阻止泡沫細胞,是防治動脈粥樣硬化有效手段。
動脈粥樣硬化的的嚴重程度和血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量呈現(xiàn)負相關。HDL-C拮抗動脈粥樣硬化的主要機制在于參與膽固醇逆轉運(RCT)過程。RCT的定義是,HDL把外周組織中過剩的膽固醇,轉運到肝臟,經(jīng)過代謝后變?yōu)槟懼崤懦鲶w外的過程,能夠阻止生成泡沫細胞,是較為公認
2、的,防止動脈粥樣硬化機制之一。在RCT過程中,細胞內(nèi)膽固醇、磷脂通過三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)轉移給apoA-I,它是HDL前體,新生成HDL,開始RCT過程,所以在RCT和新生成HDL中, ABCA1起著起始和限速作用。如果可以調(diào)節(jié) ABCA1蛋白的表達,就可以調(diào)節(jié)RCT,可以調(diào)控動脈粥樣硬化。
MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的,長度一般在22個核苷酸左右,單鏈形式存在的,非編碼的RNA。miRN
3、A與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)(UTR)互補結合,在轉錄后水平直接降解靶基因mRNA或抑制蛋白質翻譯。一個靶基因能夠被多個miRNA與其3’UTR特異結合來調(diào)控。因此,miRNA作為一類非常重要的轉錄后調(diào)節(jié)因子,與體內(nèi)代謝、增殖等病理生理過程起著重要作用,了解其詳細的調(diào)控機制,對疾病的發(fā)生和防治非常有意義。最近國內(nèi)外學者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個miRNA可調(diào)控ABCA1。在巨噬細胞、肝細胞和動脈粥樣硬化動物模型中, miR-33、 miR-758
4、、miR-106b、miR-27和miR-19b等miRNA可與ABCA1靶向結合,起到調(diào)節(jié)ABCA1的作用和調(diào)控動脈粥樣硬化的作用,提示miRNA已成為動脈粥樣硬化防治的重要靶點。
有研究表明,人動脈粥樣硬化腹主動脈瘤組織與人正常血管組織比較,miR-20a明顯升高。臨床數(shù)據(jù)顯示,冠心病患者血清中miR-20a表達較正常健康人群降低。糖尿病患者血清miR-20b較正常健康者降低。提示miR-20a/b與動脈粥樣硬化、冠心病有
5、著密切的關系,但是miR-20a/b在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的具體機制尚未明了。我們利用生物信息學靶基因預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn),miR-20a/b序列高度保守,并且miR-20a/b可與ABCA1的3’UTR靶向結合,并且二者結合自由能較低,提示結合較穩(wěn)定。
ABCA1的3’UTR較長再結合生物信息學預測結果,我們推測: miR-20a/b可能通過與ABCA1的3’UTR靶向結合,ABCA1的翻譯過程受到抑制,使ABCA1蛋白的表達減
6、少,RCT效率降低,促使發(fā)生動脈粥樣硬化;miR-20a/b是一個可以對ABCA1起抑制作用新的miRNA。
為驗證以上假說,我們擬采用以下方案進行:
1、采用熒光素酶報告基因實驗分析miR-20a/b與ABCA13’UTR的直接結合作用;
2、過表達或沉默THP-1源性、RAW264.7源性泡沫細胞的miR-20a/b,觀察細胞ABCA1表達水平、膽固醇與膽固醇酯含量及膽固醇流出率,離體研究miR-20a
7、/b對RCT的影響;
3、過表達或沉默apoE基因敲除鼠miR-20a/b,觀察對ABCA1表達水平、在體RCT效率、HDL-C水平、動脈粥樣硬化斑塊面積的影響,在體研究miR-20a/b對動脈粥樣硬化的影響。
4、臨床研究,比較冠心病患者與正常非冠心病體檢者,miR-20a/b的表達情況。
第一部分生物信息學預測和實驗驗證miR-20a/b與ABCA1靶向結合
目的:
生物信息學預測和
8、細胞實驗驗證,miR-20a/b與ABCA1靶向結合的情況。
方法:
在線打開數(shù)據(jù)庫 miRNAbase,輸入miR-20a/b查詢其序列。ABCA1的3’UTR序列在GeneBank中輸入查詢獲得。利用生物信息學在線預測數(shù)據(jù)庫分析miR-20a/b與 ABCA13’UTR的結合位點及結合自由能情況。然后進行熒光素酶報告基因實驗,首先PCR法擴增THP-1單核細胞 ABCA1的3’UTR,然后將野生型 ABCA13’
9、UTR或突變型ABCA13’UTR重組熒光素酶質粒和miR-20a/b mimic共轉染到293T細胞,最后檢測熒光素酶的活性。
結果:
成功獲取miR-20a/b序列和ABCA1的3’UTR序列。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-20a/b序列高度保守, miR-20a/b的種子序列與ABCA1的3’UTR序列完全配對,并且預測二者結合的自由能低,所預測分數(shù)很高。熒光素酶報告基因實驗證實,與con miR組比較,miR-2
10、0a/b可降低野生型ABCA1的3’UTR共轉染后熒光素酶活性,而不影響突變型ABCA1的3’UTR共轉染后熒光素酶活性。
結論:
生物信息學預測和熒光素酶報告基因實驗證實 miR-20a/b可與 ABCA1的3’UTR靶向結合。
第二部分 miR-20a/b靶向沉默泡沫細胞ABCA1表達對膽固醇流出的影響
目的:
離體研究 miR-20a/b對 THP-1源性泡沫細胞和 RAW264.
11、7源性泡沫細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達,及巨噬細胞膽固醇流出率和細胞內(nèi)膽固醇含量的影響。
方法:
利用THP-1單核細胞經(jīng)PMA分化為巨噬細胞,或常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞,然后給予ox-LDL誘導上述巨噬細胞為泡沫細胞。使用Lipo RNAiMAX轉染試劑將下述各組干預因素轉染至以上兩種泡沫細胞,分為以下7組:
?。?)對照組:正常泡沫細胞組;
(2)mimic con組:40nM m
12、imic con培養(yǎng)24h。
?。?)miR-20a mimic組:40nM miR-20a mimic培養(yǎng)24h。
(4)miR-20b mimic組:40nM miR-20b mimic培養(yǎng)24h。
(5)inhibitor con組:40nM inhibitor con培養(yǎng)24h。
(6)miR-20a inhibitor組:40nM miR-20a inhibitor培養(yǎng)24h。
13、(7)miR-20b inhibitor組:40nM miR-20b inhibitor培養(yǎng)24h。
檢測ABCA1 mRNA和蛋白的表達,使用real-time PCR和western blot法;然后測定 THP-1和RAW264.7巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出率,使用液體閃爍儀;高效液相色譜檢測細胞內(nèi)膽固醇含量。
結果:
與對照組比較,miR-20a/b mimic組ABCA1的mRNA和蛋白的表達減少,mi
14、R-20a/b inhibitor組ABCA1的mRNA和蛋白的表達增加,而mimic control和inhibitor control組ABCA1的表達無明顯變化。與對照組比較,miR-20a/b mimic組THP-1源性和RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇流出率降低,細胞內(nèi)膽固醇含量增加,而miR-20a/b inhibitor組細胞膽固醇流出率增加,細胞內(nèi)膽固醇含量降低。
結論:
miR-20a/b抑制泡沫
15、細胞ABCA1的表達,減少細胞內(nèi)膽固醇流出,增加細胞內(nèi)膽固醇含量,有利于泡沫細胞形成;miR-20a/b inhibitor可促進泡沫細胞ABCA1表達,增加細胞內(nèi)膽固醇流出,減少細胞內(nèi)膽固醇含量,抑制泡沫細胞形成。
第三部分 miR-20a/b對apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達及動脈粥樣硬化的影響
目的:
在體研究miR-20a/b對apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達,及動脈粥樣
16、硬化的影響。
方法:
給予雄性apoE-/-小鼠喂養(yǎng)高脂飲食(21%豬油+0.21%膽固醇)10周造動脈粥樣硬化模型,皮下注射化學修飾后miRNA或anti-miRNA,分為以下7組:
?。?)PBS組:給予與miR-20a等體積的PBS;
?。?)con miR組:給予10mg/kg的conrol miRNA;
?。?) miR-20a組:給予10mg/kg的miR-20a agomir;<
17、br> ?。?) miR-20b組:給予10mg/kg的miR-20b agomir;
?。?)con anti-miR組:給予10mg/kg的conrol anti-miRNA;
?。?)anti-miR-20a組:給予10mg/kg的anti-miR-20a;
?。?)anti-miR-20b組:給予10mg/kg的anti-miR-20a。
檢測小鼠肝臟ABCA1 mRNA和蛋白的表達,使用rea
18、l-time PCR和western blot法。腹腔注射3H-膽固醇RAW264.7巨噬細胞,48h后收集小鼠的血清、肝臟及48h糞便,用液體閃爍計數(shù)測定 RAW264.7巨噬細胞在體膽固醇逆轉運效率;酶氧化法檢測甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總膽固醇等血脂水平;檢測小鼠主動脈動脈粥樣硬化病變程度,使用油紅O病理染色和HE病理染色。
結果:
miR-20a/b
19、抑制apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達,降低小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量,使HDL-C水平下降,LDL-C含量升高,最終使得主動脈動脈粥樣硬化程度加重;而anti-miR-20a/b上調(diào)apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達,增加小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量,增加小鼠HDL-C水平,降低LDL-C水平,減輕主動脈動脈粥樣硬化病變程度。
結論:
20、> miR-20a/b可通過靶向沉默ABCA1的表達,影響血脂水平,加重動脈粥樣硬化病變;Anti-miR-20a/b可促進ABCA1的表達,改善血脂水平,減輕動脈粥樣硬化病變,為動脈粥樣硬化的治療提供新的思路。
第四部分冠心病患者血清miR-20a/b的表達及意義
目的:
研究冠心病患者血清miR-33和miR-20a/b的表達情況,初步闡明miR-20a/b在冠心病患者中的臨床意義。
方法:
21、
收集山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院心血管內(nèi)科冠脈造影證實的冠心病患者40例,所有患者無高血壓病、無糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L為冠心病組;收集社區(qū)正常體檢人群,無高血壓病、無糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L的正常體檢人群40例為對照組。采用生化試劑盒檢測相關生化指標,用Real time PCR法檢測miR-33和miR-20a/b的表達。對miR-33和miR-20a/b與HDL,LDL進行相關性分析,后進行非條
22、件logistic回歸多因素分析miR-33和miR-20a/b是否為冠心病獨立危險因素。
結果:
與健康對照組比較,冠心病組吸煙比例和飲酒比例較對照組高,BMI高,而HDL-C低。冠心病組miR-33和miR-20a/b表達均降低。對miR-33和miR-20/b與HDL-C與LDL-C相關性分析發(fā)現(xiàn),對照組,miR-33和miR-20a/b與HDL-C成負相關,但miR-33無統(tǒng)計學意義,miR-20a/b有統(tǒng)計
23、學意義。對照組三個miRNA與LDL相關性均無統(tǒng)計學意義。冠心病組,miR-33、miR-20a/b與HDL成正相關,miR-20a與miR-33有統(tǒng)計學意義,miR-20b無統(tǒng)計學意義。冠心病組僅miR-20a與LDL成負相關,有統(tǒng)計學意義。多因素分析發(fā)現(xiàn),BMI,吸煙,miR-33和miR-20a是冠心病的獨立影響因素,但吸煙和miR-33的OR95%可信區(qū)間包括了1。
結論:
冠心病患者miR-33和miR-2
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