脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及脂聯(lián)素對(duì)其影響.pdf

1、背景：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD )是代謝綜合征(MS)的肝臟表現(xiàn)，常存在脂質(zhì)代謝紊亂，表現(xiàn)為高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia)伴或不伴高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)。后者可引發(fā)心血管疾病等多種并發(fā)癥，危害較大。膽固醇主要在肝臟代謝，脂肪肝時(shí)肝臟膽固醇代謝的變化尚不清楚；對(duì)脂肪肝高脂血癥的控制目前尚無(wú)特效藥物。脂聯(lián)素(APN)是近年新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞分泌的激素，與代謝綜合征密切相關(guān)，具

2、有抗炎、增加胰島素敏感性、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用。研究證實(shí)脂聯(lián)素可抑制脂肪變性肝細(xì)胞甘油三酯的合成，但對(duì)肝細(xì)胞膽固醇代謝的影響尚不知。本研究擬從細(xì)胞水平觀察脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及其合成相關(guān)基因的表達(dá)變化及脂聯(lián)素對(duì)其影響。 第一部分肝細(xì)胞脂肪變性模型的建立 目的：以一定濃度軟脂酸(PA)作用于正常成人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，建立肝細(xì)胞脂肪變性模型。方法：MTT比色法確定軟脂酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的適宜濃度；油紅O染色觀察軟脂酸處

3、理后細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況；反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)含量。結(jié)果：10ug/ml、20ug/ml的軟脂酸作用于肝細(xì)胞3天后，均可造成肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，油紅O染色細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)堆積，脂滴數(shù)明顯增多；10ug/ml軟脂酸處理組細(xì)胞內(nèi)TG含量比對(duì)照組顯著增多，TC含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別；20ug/ml軟脂酸處理組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量均比對(duì)照組和10ug/ml組顯著增加。結(jié)論：軟脂酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞

4、脂肪變性，成功建立肝細(xì)胞脂肪變性模型；脂變肝細(xì)胞存在膽固醇代謝異常。 第二部分脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)變化 目的：探討肝細(xì)胞脂肪變性后膽固醇合成代謝相關(guān)基因表達(dá)變化。方法：細(xì)胞分為三組，對(duì)照組、PA-10組和PA-20組，分別給予不含PA的RPMI-1640培養(yǎng)液、含10ug/mlPA、含20ug/mlPA的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)3天。收集細(xì)胞，RT-PCR方法檢測(cè)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP

5、-2)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGGCR) mRNA表達(dá)變化。結(jié)果： PA-10組SREBP-2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，HMGCR mRNA表達(dá)比對(duì)照組顯著增加；PA-20組SREBP-2、HMGCR mRNA表達(dá)則顯著高于對(duì)照組和PA-10組。結(jié)論：肝細(xì)胞脂肪變性后膽固醇合成代謝相關(guān)基因SREBP-2、HMGCR mRNA表達(dá)上調(diào)。 第三部分脂聯(lián)素對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

6、目的：檢測(cè)脂聯(lián)素對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法：將細(xì)胞分為三組，對(duì)照組1(PA-20)：培養(yǎng)基中加入軟脂酸終濃度為20ug/ml，培養(yǎng)3天后給予無(wú)軟脂酸RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)；脂聯(lián)素處理組(APN)：培養(yǎng)基中加入軟脂酸終濃度為20ug/ml，培養(yǎng)3天后給予含10ug/ml脂聯(lián)素的無(wú)軟脂酸RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)；對(duì)照組2(空白對(duì)照)：僅予RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天。結(jié)果：APN