金屬蛋白酶組織抑制劑對兔動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞及巨噬細胞的功能影響研究.pdf

1、心腦血管疾病現(xiàn)已成為人類生命健康的頭號殺手，研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈瘤、心肌梗塞等心腦血管疾病最主要的病理基礎。因此，AS的早期預防和治療對于提高人們的生活質(zhì)量有著重要的意義。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一類依賴于鋅、鈣離子的內(nèi)肽酶，其在生理條件下幾乎能降解所有細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分。在血

2、管內(nèi)皮損傷及炎性細胞浸潤、血管重構(gòu)、粥樣斑塊形成及發(fā)展過程中，均起著重要作用。金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metallo-proteinases，TIMPs)是MMPs的天然拮抗劑，它通過對MMPs的抑制在正常ECM改建和各種病理過程中發(fā)揮著重要作用。大量研究證明動脈粥樣硬化及動脈瘤病變局部MMPs和TIMPs比例失衡，MMPs水平增高及TIMPs水平降低。
　　基于以上認識，我們設想以覆膜血管內(nèi)

3、支架為載體，實現(xiàn)主動脈壁局部功能基因轉(zhuǎn)染，提高主動脈壁局部TIMP水平，抑制MMPs的蛋白水解作用，從而改善血管結(jié)構(gòu)。在主動脈壁局部功能基因轉(zhuǎn)染前，我們先評價TIMPs對參與動脈粥樣硬化及動脈瘤病變關(guān)系最密切的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)及巨噬細胞的功能影響，以便為進一步選擇目的治療基因?qū)崿F(xiàn)主動脈局部基因轉(zhuǎn)染并促進主動脈病變修復提供實驗基礎。
　　本研究分為三部分:
　　

4、第一部分:胰彈性蛋白酶浸潤加高脂飲食法建立兔腹主動脈粥樣硬化模型。
　　目的:評價在高脂飼料喂養(yǎng)基礎上采用胰彈性蛋白酶(pancreatic elastase，PE)浸潤法制備兔主動脈粥樣硬化模型的可行性。
　　方法:分別采用高脂飼料喂養(yǎng)+PE浸潤法及高脂飼料喂養(yǎng)+球囊損傷法制備兔AS模型，設立正常飲食組作為對照。通過生化指標、影像學檢查、病理形態(tài)學及免疫組織化學檢測評價高脂飼料喂養(yǎng)+PE浸潤法造模結(jié)果，并與正常飲食組及高脂

5、飼料喂養(yǎng)+球囊損傷法造模結(jié)果相比較。
　　結(jié)果:血管造影檢查，PE浸潤局部管腔較正常血管略擴張，形態(tài)不規(guī)整，有進一步縮小趨勢。病理形態(tài)學檢測，PE浸潤組動脈內(nèi)膜增厚，伴有脂質(zhì)沉積，可見斑塊形成。半定量分析PE組及球囊損傷組彈性蛋白成分明顯低于正常對照組，兩實驗組間比較無統(tǒng)計學差異。免疫組織化學檢測，PE浸潤組及球囊損傷組MMP-9，MMP-2及巨噬細胞免疫染色與對照組相比均顯示出較高水平的蛋白表達，對照組沒有MMP-2、MMP-9

6、及巨噬細胞表達，兩實驗組間沒有明顯差異。
　　結(jié)論:高脂飼料喂養(yǎng)加PE浸潤法處理后，局部血管病理形態(tài)學及免疫組織化學結(jié)果都與AS改變相符合，證實了PE浸潤動脈外周后損傷內(nèi)膜的有效性及制備AS模型的可行性。
　　第二部分:TIMPs對兔動脈粥樣硬化血管壁平滑肌細胞遷移、凋亡、增殖的功能影響及機制探討。
　　目的:評價不同濃度TIMP-1，2，3對兔動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle

7、cell，VSMC)體外遷移、凋亡、增殖功能的影響及機制探討。
　　方法:采用transwell小室法進行VSMC的遷移實驗，通過比較遷移細胞數(shù)量評價TIMPs對遷移能力的影響。通過BrdU熒光染色，評價TIMPs對VSMC增殖能力的影響。采用流式細胞術(shù)檢測VSMC凋亡。
　　結(jié)果:遷移實驗:不同濃度TIMP-1，2，3組鏡下計數(shù)遷移細胞數(shù)與對照組相比均有減少。增殖實驗:3ng/ml濃度TIMP-1，2，3鏡下計數(shù)核染細胞數(shù)

8、與對照組相比無差別，其余各濃度實驗組核染細胞數(shù)與對照組相比均有減少。凋亡實驗:各濃度TIMP-1組VSMC凋亡率與對照組相比無統(tǒng)計學差異，10ng/ml-100ng/ml濃度TIMP-2，3組VSMC早期凋亡率與對照組相比有降低。
　　結(jié)論:濃度3ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3對VSMC體外遷移有抑制作用;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3對VSMC體外增殖有抑制作用，濃度3ng/ml

9、TIMP-1，2，3對VSMC體外增殖無作用;TIMP-1對VSMC早期凋亡無影響，10ng/ml-100ng/ml濃度TIMP-2，3對VSMC早期凋亡有抑制作用。
　　第三部分:TIMPs對兔腹腔巨噬細胞體外遷移、凋亡、MMP-9合成功能的影響及機制研究。
　　目的:評價不同濃度TIMP-1，2，3對兔腹腔巨噬細胞體外遷移、凋亡及MMP-9合成功能的影響。
　　方法:采用transwell小室法進行巨噬細胞的遷移實

10、驗，流式細胞術(shù)檢測VSMC凋亡，Western blotting法檢測巨噬細胞合成MMP-9含量變化。
　　結(jié)果:濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組遷移細胞數(shù)與對照組相比有明顯減少，各濃度TIMP-1實驗組及濃度3ng/ml TIMP-2，3實驗組遷移細胞數(shù)與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組巨噬細胞早期凋亡率與對照組相比有降低，各濃度TIMP-1實驗組巨噬細胞

11、凋亡率與對照組相比無統(tǒng)計學差異;濃度10 ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組MMP-9條帶灰度值均低于對照組。
　　結(jié)論:濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3對兔腹腔巨噬細胞體外遷移有抑制作用。TIMP-1及低濃度（3ng/ml）TIMP-2，3對巨噬細胞遷移無影響;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3對兔腹腔巨噬細胞凋亡有抑制作用，TIMP-1對巨噬細胞凋亡無影響;濃度10ng/