解糖假蒼白桿菌Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10還原Cr(Ⅵ)的機(jī)制研究.pdf

1、鉻是一種重要的工業(yè)原料，被廣泛地應(yīng)用于印染、電鍍、制革、合金生產(chǎn)等行業(yè)中。由于對(duì)含鉻廢物的不合理處理處置，導(dǎo)致了嚴(yán)重的土壤鉻污染問(wèn)題。鉻在環(huán)境中主要以Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)兩種價(jià)態(tài)存在。其中，Cr(Ⅵ)具有致畸、致癌等高毒性;而Cr(Ⅲ)化合物的溶解度低，生物毒性小。因此，將高毒性的Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)是Cr(Ⅵ)解毒和鉻污染土壤修復(fù)的基本思路。與傳統(tǒng)的化學(xué)還原法相比，利用微生物還原Cr(Ⅵ)具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，在大面積、中

2、低濃度鉻污染土壤修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 由于鉻污染土壤多呈堿性、高鹽的特點(diǎn)，因此，本論文以高pH、高鹽分含量、高Cr(Ⅵ)濃度作為選擇壓力，篩選獲得耐鹽耐堿的土著Cr(Ⅵ)還原微生物——解糖假蒼白桿菌LY10(Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10)，并對(duì)其還原行為進(jìn)行了研究。繼而采用透射電鏡-能譜(TEM-EDS)、X射線吸收光譜(XAS)、電子順磁共振(EPR)、X射線熒光光譜

3、（XRF）和軟X射線譜學(xué)顯微光束線等現(xiàn)代微結(jié)構(gòu)分析技術(shù)系統(tǒng)研究了該微生物的Cr(Ⅵ)還原位置，微生物作用下鉻的分子形態(tài)變化，以及非飽和生物膜對(duì)鉻的吸收還原規(guī)律。從分子水平上初步闡明了解糖假蒼白桿菌P.saccharolyticum LY10還原Cr(Ⅵ)的分子機(jī)制，旨在為鉻污染土壤微生物修復(fù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。研究成果主要包括:
　　 (1)篩選獲得了耐鹽耐堿的土著Cr(Ⅵ)還原微生物。從鉻污染土壤篩選獲得四株Cr(Ⅵ)還原

4、微生物，分別命名為菌株LY6、LY8、LY10和LY11。根據(jù)生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性比對(duì)，分別鑒定為:不解糖假蒼白桿菌、溶血不動(dòng)桿菌、解糖假蒼白桿菌和干丘亮桿菌;首次報(bào)道了不解糖假蒼白桿菌和解糖假蒼白桿菌的Cr(Ⅵ)耐受和還原能力;在四株微生物中，解糖假蒼白桿菌LY10表現(xiàn)出耐鹽、耐堿、耐Cr(Ⅵ)的綜合優(yōu)勢(shì)，并具有較強(qiáng)的Cr(Ⅵ)還原能力和細(xì)胞存活能力，可耐受400 mg L-1 Cr(Ⅵ)、60g L-1 Na

5、Cl、pH11.3，并能在156mg L-1 Cr(Ⅵ)脅迫下存活12d以上。菌株LY10為后續(xù)研究提供了一種良好材料。
　　 (2)考察了菌株LY10的Cr(Ⅵ)還原行為。氧氣的存在是菌株LY10生長(zhǎng)和進(jìn)行Cr(Ⅵ)還原的基本所需，其優(yōu)化的Cr(Ⅵ)還原條件是:培養(yǎng)溫度28℃，pH8.3，NaCl添加濃度量20 g L-1，菌體接種量1.47×109 cells mL-1，在該優(yōu)化條件下，菌株LY10可在96 h內(nèi)將55 mg

6、 L-1 Cr(Ⅵ)全部去除;1 mM Fe(Ⅲ)可促進(jìn)菌株LY10對(duì)Cr(Ⅵ)的還原，1 mM Zn(Ⅱ)和Al(Ⅲ)則具有抑制作用;LY10對(duì)Cr(Ⅵ)的還原可分為先快后慢兩個(gè)階段，初始階段(0～72h)內(nèi)的Cr(Ⅵ)還原過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，在最優(yōu)還原條件下，一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)達(dá)到最大值(0.0445 h-1)。
　　 (3)明確了菌株LY10的Cr(Ⅵ)還原位置。菌株LY10主要通過(guò)胞外還原的方式去除培養(yǎng)液中Cr(Ⅵ)，

7、絕大多數(shù)鉻存在于培養(yǎng)液中，菌體細(xì)胞對(duì)鉻的固定量較少(5.1％～7.1％);在亞細(xì)胞水平上，胞外多聚物和細(xì)胞壁是細(xì)胞中鉻的主要分布區(qū)，僅有少量鉻進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi);胞外多聚物在菌株LY10耐受Cr(Ⅵ)和還原Cr(Ⅵ)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是菌株LY10的主要Cr(Ⅵ)還原位置;在高濃度Cr(Ⅵ)脅迫條件下，LY10分泌出更多的胞外多聚物包裹于細(xì)胞外，一方面通過(guò)還原作用將高毒性Cr(Ⅵ)進(jìn)行還原，另一方面通過(guò)吸附作用對(duì)重金屬鉻進(jìn)行攔截。通過(guò)細(xì)

8、胞壁的進(jìn)一步截留作用，從而有效阻止毒性鉻進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。
　　 (4)闡明了菌株LY10作用過(guò)程中鉻的分子形態(tài)變化。在菌株LY10的作用下,Cr(Ⅵ)先接受一個(gè)電子生成中間產(chǎn)物Cr(Ⅵ)，隨后再經(jīng)過(guò)兩個(gè)電子的傳遞生成穩(wěn)定產(chǎn)物Cr(Ⅲ);在單細(xì)胞水平，絕大多數(shù)Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)都分布在細(xì)胞周邊的胞外多聚物中，僅有少量Cr(Ⅵ)進(jìn)入細(xì)胞并分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞外還原產(chǎn)物Cr(Ⅲ)則被截留在胞外多聚物和細(xì)胞壁中;菌體中的鉻絕大部分為Cr

9、(Ⅲ)，其中，53.6％的鉻以磷酸鉻類似物的形式存在，此外還包含少量的醋酸鉻(24.4％)和硫酸鉻(19.7％)。
　　 (5)揭示了在類似土壤的水份非飽和環(huán)境中，LY10非飽和生物膜對(duì)鉻的吸收還原規(guī)律。生物膜對(duì)鉻的吸收累積是一個(gè)快速的過(guò)程，在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)前期(10～30min)，鉻主要分布在生物膜底部靠近培養(yǎng)基層，轉(zhuǎn)運(yùn)中期(1～12 h)，鉻在生物膜底端和生物膜頂端均有聚集，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，頂端鉻富集區(qū)逐漸往底部趨近，在吸收