解淀粉芽孢桿菌SQR9增強植物耐鹽能力的機制研究.pdf

1、目前，世界上有20％的耕地受到鹽害的影響，過量的鹽分會影響作物生長，導致產量降低，嚴重限制農作物的產出。鹽害除了會導致植物離子毒害和滲透脅迫，還會引起氧化傷害，因此有必要采取一些有效措施來增強植物的耐鹽能力，其中根際促生菌(PGPR)被認為可以有效增強植物耐鹽脅迫能力。解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）SQR9是本實驗室在健康黃瓜根際篩選到的一株根際促生菌，可以顯著地促進黃瓜植物的生長。以SQR9為添加

2、菌劑的生物有機肥可以有效地促進植物生長，抑制土傳病害的發(fā)生。
　　本文發(fā)現解淀粉芽孢桿菌SQR9不僅對植物有促生作用，還可以顯著的增強植物對鹽脅迫的耐受能力。通過研究接種SQR9對鹽脅迫下植物耐鹽相關生理指標和基因轉錄的影響，初步確定SQR9誘導植物耐鹽脅迫的途徑。通過對SQR9誘導植物耐鹽脅迫的信號物質的研究及擬南芥突變體驗證，確定了SQR9誘導植物耐鹽脅迫的主要途徑，并發(fā)現亞精胺為SQR9產生的誘導植物耐鹽的重要信號物質。獲得

3、如下主要結果:
　　在水培和瓊脂培養(yǎng)條件下，解淀粉芽孢桿菌SQR9可以增強玉米、水稻和擬南芥三種作物在不同鹽濃度下的耐鹽能力。在100 mM NaCl下，接種SQR9的玉米的莖葉和根部鮮重分別是對照組玉米的2.69倍和1.78倍，接種SQR9的擬南芥的莖葉和根部鮮重分別是對照組的2.85倍和1.9倍，且接種SQR9導致植物根部側根的數量顯著增加。
　　在鹽脅迫下，SQR9可以通過調控多個基因的表達來影響植物相關生理指標，如葉

4、綠素、光合速率、脫落酸(ABA)、滲透調節(jié)物可溶性總糖(TSS)、抗氧化物酶、還原型谷胱甘肽(GSH)和Na+含量。RBCS和RBCL是植物光合作用關鍵基因，SQR9可以通過提高玉米內的ZmRBCS、ZmRBCL基因和擬南芥內AtRBCS、AtRBCL基因的轉錄水平來增強植物光合作用。同時在鹽脅迫下，SQR9接種的玉米葉綠素和類胡蘿卜素含量分別是未接種對照的1.84和1.44倍，而接種SQR9的擬南芥葉綠素和類胡蘿卜素分別是對照組的3.

5、39倍和3.35倍，同時在鹽脅迫下SQR9的接種顯著增強了玉米和擬南芥的光合速率。在鹽害下，植物會通過提高ABA含量來調控氣孔減少水分的喪失，而在鹽脅迫下，接種SQR9分別降低了玉米和擬南芥內ZmNCED和AtNCED3基因(ABA合成的關鍵基因)的轉錄水平，抑制了玉米和擬南芥中ABA含量的升高。接種SQR9將玉米和擬南芥TSS含量增加為對照的2.29倍和1.47倍。接種SQR9雖然顯著提高了玉米的過氧化物酶(POD)活性，但對擬南芥P

6、OD活性并沒有顯著的影響。接種SQR9的玉米的過氧化氫酶(CAT)活性是對照（添加等量失活SQR9菌液處理組）的1.75倍，接種SQR9的擬南芥的CAT活性增加到對照的2.19倍。接種SQR9的玉米內GSH含量是對照組的2.43倍，接種SQR9的擬南芥內GSH含量提高到對照組的2.49倍。在鹽脅迫下，接種SQR9的植物內過氧化氫的含量顯著低于未接種SQR9的植物。通過分根實驗發(fā)現，在鹽脅迫下接種SQR9導致根系環(huán)境中Na+含量顯著高于未

7、接種對照，說明SQR9能夠協(xié)助植物排除Na+或者減少Na+的攝入。同時接種SQR9分別增加了玉米和擬南芥中Na+轉運相關基因的轉錄水平，如SQR9增加了玉米中ZmNHX1，ZmNHX2，ZmNHX3和ZmH+-PPase基因的轉錄水平和擬南芥中AtNHX1和AtNHX7基因的轉錄水平，從而減少Na+對植物造成的傷害。
　　通過透析袋截留不同分子量的SQR9分泌物，發(fā)現誘導植物耐鹽的SQR9信號物質的大小在100 Da到500 Da

8、之間。通過進一步檢測該范圍內的分泌物所影響的植物耐鹽途徑，發(fā)現100～500 Da的SQR9分泌物主要通過提高玉米的GSH含量并減少Na+含量來促進植物的鹽脅迫耐受性。而在擬南芥中，100～500 Da的SQR9信號物質能夠增強CAT的活性、提高GSH含量并減少植物體內Na+含量。并且，利用相關的擬南芥突變體進行驗證，發(fā)現GSH合成相關基因(GS和GR)的敲除導致接種SQR9不能增強植物耐鹽能力，以及鹽過敏反應(SOS)途徑關鍵基因(S

9、OS1，SOS2，SOS3和NHX1)的敲除也會導致接種SQR9不能增強植物耐鹽能力，該結果進一步證明了GSH含量的增加以及對SOS途徑的調控是SQR9100～500Da的信號物質協(xié)助植物耐受鹽脅迫的主要途徑。
　　在對SQR9分泌的誘導植物耐受鹽脅迫的信號物質的進一步研究中，我們發(fā)現SQR9產生的揮發(fā)性物質(VOCs)不能顯著增強鹽脅迫下擬南芥的生物量，說明VOCs并非是SQR9誘導植物耐鹽脅迫的信號物質。△ysnE是SQR9的

10、突變體，突變菌株的吲哚乙酸(IAA)產量顯著降低了86％，通過用△ysnE接種鹽脅迫下的擬南芥，其相對應的擬南芥鮮重和側根數目與接種野生型SQR9的擬南芥相比有所下降，但是與對照相比仍可以顯著增強鹽害下擬南芥的生物量，結果表明IAA并非是SQR9誘導植物耐鹽脅迫的主要信號物質。通過用乙酸乙酯、乙醚、正戊烷、氯仿和水相萃取100～500Da的SQR9發(fā)酵液，發(fā)現在鹽脅迫下，擬南芥莖葉的生物量在添加未經過萃取的SQR9發(fā)酵液、水相SQR9發(fā)

11、酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液的處理中相對于對照組分別提高了75.75％、34.68％、53.21％和95.43％。而只有未經過萃取的SQR9發(fā)酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液導致擬南芥根鮮重的顯著增加，增加幅度分別為35.75％、20.75％和70.9％，乙酸乙酯和正戊烷萃取的SQR9發(fā)酵液并沒有顯著增加擬南芥生物量。其中氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液誘導植物耐鹽脅迫效果最佳，因此推測SQR

12、9信號物質應極易被氯仿萃取。據報道，100～500 Da之間的潛在的促進植物耐受鹽脅迫的物質主要包括赤霉素、玉米素、海藻糖和多胺類，通過液相色譜(HPLC)檢測SQR9發(fā)酵液，發(fā)現SQR9不能產生精胺，只能產生亞精胺。此外通過檢測100～500 Da的潛在信號物質在上述溶劑中的溶解度，發(fā)現只有亞精胺在氯仿中的溶解度較高，該結果顯示，SQR9所分泌的能夠誘導植物耐受鹽脅迫的信號物質可能是亞精胺。實驗發(fā)現，外源亞精胺增強植物耐鹽的有效濃度范

13、圍是1～10μM，但是當濃度大于500μM時對植物生長有抑制甚至致死作用。我們在SQR9找到了完整的亞精胺合成途徑，并通過同源重組雙交換，敲除SQR9內亞精胺合成關鍵基因speB，得到突變子△speB，并構建了相應的互補菌株c-△speB。通過HPLC對野生型SQR9、△speB、c-△speB菌株的亞精胺的產量進行了分析，野生型SQR9和c-△speB胞外亞精胺的產量分別是26.40μM和22.20μM(OD600=1.0)，胞內亞精

14、胺的產量是29.93和26.59μM(OD600=1.0)，而突變子幾乎不產亞精胺，突變子和互補菌株的生長曲線與野生型無顯著差異，說明speB基因的敲除和互補載體的融入并沒有影響到細菌的生長。接種突變子△speB不能增強植物的耐鹽能力，互補菌株c-△speB仍可以顯著增強植物耐鹽能力，說明亞精胺是SQR9誘導植物耐鹽脅迫的重要信號物質。進一步研究發(fā)現，亞精胺能夠促進植物GSH合成相關基因GS和GR的表達，并提高植物GSH含量，從而緩解植

15、物受到的氧化傷害;還能夠調控液泡上Ca2+通道蛋白基因TPC1的表達來改變細胞質內Ca2+含量，從而激活SOS途徑，并提高液泡膜和細胞膜上的Na+通道蛋白基因NHX1和NHX7的表達來調節(jié)Na+的區(qū)域化，從而減少了植物細胞質內的Na+含量。
　　綜上所述，SQR9能夠通過影響植物多條途徑促進植物對鹽脅迫的耐受能力，主要通過合成亞精胺來促進植物GSH的合成，從而緩解植物受到的氧化傷害;通過調控細胞質內Ca2+含量來激活SOS途徑;以