還原型β2糖蛋白I抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞VEGF-NO軸解偶聯(lián)的機制.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見和最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，亦是導致終末期腎功能衰竭的重要原因。我國DN的患病率呈快速增長的趨勢，DN已成為糖尿病患者致死的主要原因之一。DN的發(fā)病機制復雜，近來研究發(fā)現(xiàn)VEGF-NO軸解耦聯(lián)是DN的致病機制之一。我們前期研究證實還原型β2糖蛋白I（reducedβ2-Glycoprotein I，r-β2GPI）可調節(jié)VEGF信號通路，抑制糖尿病

2、視網(wǎng)膜病變新生血管形成，此外r-β2GPI可抑制TGF-β1-p38 MAPK信號途徑減輕糖尿病小鼠腎病的程度及抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞IV型膠原的表達。本研究以大鼠腎小球系膜細胞系HBZY-1為研究對象，旨在探討：1.β2GPI及r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞VEGF-NO軸功能的影響；2.β2GPI及r-β2GPI影響高糖條件下HBZY-1細胞VEGF-NO軸功能的機制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)HBZY

3、-1細胞。實驗共分為6組：①正常對照組（NC組）：5.5mM葡萄糖；②高滲對照組（MC組）：5.5mM葡萄糖+19.5mM甘露醇；③高糖組（HG組）：25mM葡萄糖；④高糖+ HSA對照組（HSA組）：25mM葡萄糖+100μg/ml HSA；⑤高糖+β2GPI干預組（β2GPI組）：25mM葡萄糖+100μg/mlβ2GPI；⑥高糖+ r-β2GPI干預組（r-β2GPI組）：25mM葡萄糖+100μg/ml r-β2GPI。

4、　　2. NO測試盒測定β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞分泌NO的影響；采用 ROS熒光探針 DCFH-DA，通過熒光顯微鏡定性觀察及流式細胞儀定量檢測β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞生成ROS的影響。
　　3. qRT-PCR法檢測β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞VEGF-NO軸相關蛋白VEGF、VEGFR-2、eNOS、GCH-1 mRNA表達的影響。
　

5、　4. Western Blot法觀察β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞VEGF-NO軸關鍵蛋白eNOS活性的影響及對VEGF受體后信號轉導通路中Akt磷酸化水平的影響。
　　結果：
　　1.高糖可明顯抑制HBZY-1細胞NO的生成達33％（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可拮抗高糖引起的NO表達減少，促進NO的生成（P＜0.05），且r-β2GPI天津醫(yī)科大學碩士學位論文
　　的作用強于

6、β2GPI，分別是HG組的2.10倍、1.88倍（P＜0.05）。
　　2.與正常對照組相比，高滲及高糖均促進HBZY-1細胞ROS的生成（P＜0.05），高糖條件下HG組及HSA組兩組間ROS平均熒光強度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），均明顯高于NC組和MC組（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可抑制高糖條件下HBZY-1細胞ROS的生成，降低ROS水平（P＜0.05），且r-β2GPI的作用強于β2GPI（P＜0.05）

7、。
　　3.高糖可促進HBZY-1細胞VEGF、VEGFR-2 mRNA的表達（P＜0.05），抑制GCH-1 mRNA的表達（P＜0.05），但對eNOS mRNA的表達無明顯影響（P＞0.05）。β2GPI及r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細胞VEGF的表達無明顯影響（P＞0.05），可降低高糖條件下VEGFR-2 mRNA的表達水平（P＜0.05），增加高糖條件下GCH-1、eNOS mRNA的表達。β2GPI組和r-

8、β2GPI組兩組間VEGF、VEGFR-2、GCH-1、eNOS mRNA的表達水平均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.高糖抑制HBZY-1細胞eNOS Ser1177的磷酸化（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可提高高糖條件下eNOS Ser1177的磷酸化水平（P＜0.05），兩者之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　5.高糖抑制HBZY-1細胞Akt的磷酸化（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可

9、促進高糖條件下Akt的磷酸化（P＜0.05），兩者之間的作用無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論：
　　1.高糖環(huán)境下HBZY-1細胞VEGF、VEGFR-2 mRNA水平升高，GCH-1 mRNA表達減少，eNOS mRNA表達無明顯改變，但eNOS磷酸化水平明顯降低，致NO分泌減少且ROS生成增加，即存在高糖誘導下的系膜細胞VEGF-NO軸解偶聯(lián)。
　　2.β2GPI及r-β2GPI均可拮抗高糖環(huán)境下HBZY-1細胞NO分

10、泌減少和ROS生成增多，促進GCH-1 mRNA的表達，降低VEGFR-2 mRNA的表達水平，促進Akt磷酸化，提高eNOS的磷酸化水平?？赡軝C制為β2GPI及r-β2GPI通過調節(jié)VEGFR-2的表達及VEGF受體后信號通路中的關鍵蛋白Akt的磷酸化水平，激活eNOS，增加NO分泌，減輕氧化應激水平，對高糖環(huán)境下的系膜細胞起保護作用。
　　3.與β2GPI相比，r-β2GPI促進HBZY-1細胞NO分泌、抑制ROS生成的作用更