家蠶中一個(gè)新的膜蛋白基因HW的融合表達(dá)和純化.pdf

1、本研究從實(shí)驗(yàn)室的膜蛋白庫(kù)中篩選出一個(gè)膜蛋白,通過(guò)分析預(yù)測(cè)這個(gè)蛋白有三個(gè)跨膜區(qū),為一個(gè)未知功能的膜蛋白,將其命名為HW。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),HW基因cDNA全長(zhǎng)1230bp,開放閱讀框(ORF)大小為294 bp,編碼97個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量大小約為10.93kD?；谀さ鞍纂y表達(dá)的問(wèn)題,本課題利用多角體融合表達(dá)分別在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中表達(dá)該膜蛋白基因。根據(jù)HW基因cDNA序列的ORF框設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,PCR擴(kuò)增出目的基因,克隆到

2、本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的融合多角體基因的載體pBacPAK8-Ph獲得重組載體pBacPAK8-Ph-HW,該載體可以將HW基因與多角體基因融合,兩者之間插入TEV酶基因序列,便于HW膜蛋白與多角體蛋白的分離。雙酶切pBaePAK8-Ph-HW載體獲得Ph-HW片段,克隆到pET-28a(+)相同酶切位點(diǎn)獲得重組原核表達(dá)載體pET-28aq(+)-Ph-HW,將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)E.coli感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR、BamHⅠ/

3、NotⅠ酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組正確。采用終濃度為1mM的IPTG、28℃條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),裂解菌體SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)有大小約40kD的目的條帶。利用親和層析方法純化融合蛋白后,TEV酶酶切得到膜蛋白HW。家蠶細(xì)胞表達(dá)該目的蛋白,根據(jù)Bac-to-Bac系統(tǒng),將上述獲得的HW與多角體融合基因Ph-HW片段插入到pFastBacTMHTB載體構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-Ph-HW,將pFastBac-Ph-HW重組載

4、體轉(zhuǎn)化E.coli DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞。重組pFastBae-Ph-HW載體與穿梭載體bacmid發(fā)生同源重組,獲得重組bacmid桿粒。重組成功的bacmid轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞,收集重組桿狀病毒繼續(xù)感染家蠶細(xì)胞,三次感染細(xì)胞后的重組桿狀病毒用來(lái)大量感染家蠶正常細(xì)胞,收集感染的細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析,結(jié)果表明多角體融合的家蠶HW基因在家蠶細(xì)胞中成功表達(dá)。家蠶細(xì)胞中HW基因的RNAi實(shí)驗(yàn)表明該基因?qū)倚Q