多角體融合的家蠶B細(xì)胞受體相關(guān)膜蛋白BmBCRA的高效表達(dá)、純化及功能研究.pdf

1、膜蛋白是生物膜系統(tǒng)含有的一類蛋白,是生物膜功能的主要承擔(dān)者。膜蛋白的強(qiáng)疏水性和細(xì)胞毒性等原因,導(dǎo)致其表達(dá)純化和結(jié)晶非常困難。多角體(Polh)蛋白可促進(jìn)外源基因表達(dá),融合表達(dá)產(chǎn)物形成的包涵體顆粒于堿性緩沖液中可溶解,利用多角體的溶解度特性,可用調(diào)pH和離心的方法來便捷地純化目的蛋白。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是高效的真核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)量高且具有翻譯后修飾過程,其采用多角體強(qiáng)啟動(dòng)子,可表達(dá)一些難表達(dá)的蛋白,如膜蛋白。B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31(BC

2、RA/BAP31)屬于BAP31超家族,其參與B細(xì)胞活化過程和膜泡運(yùn)輸,具有抗凋亡功能。在家蠶里,該蛋白的相關(guān)研究還未見報(bào)道。
　　 從本實(shí)驗(yàn)室的家蠶蛹cDNA文庫中篩選到一個(gè)編碼家蠶B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白的基因(BmBCRA),在GenBand上的登錄號是AK386415.1。構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a-Polh-BmBCRA,在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)了融合蛋白,未加多角體標(biāo)簽的BmBCRA沒有表達(dá),說明多角體能促

3、進(jìn)膜蛋白表達(dá)。利用多角體特性,通過調(diào)pH和分子篩分離純化了目的蛋白Polh-BmBCRA,并對其進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定和抗體制備,進(jìn)一步用TEV蛋白酶對融合蛋白進(jìn)行酶切,獲得了切除Polh標(biāo)簽的膜蛋白。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了重組病毒vPolh-BmBCRA。轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞,發(fā)病后經(jīng)Western blotting鑒定,結(jié)果顯示,融合蛋白在家蠶細(xì)胞中成功表達(dá),未加多角體標(biāo)簽的BmBCRA沒有表達(dá),說明多角體在家蠶細(xì)胞中同樣能促進(jìn)膜

4、蛋白表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建重組病毒vEGFP和vBmBCRA-EGFP,感染家蠶細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察,和單獨(dú)表達(dá)vEGFP的細(xì)胞相比,表達(dá)BmBCRA-EGFP的細(xì)胞,其綠色熒光主要集中在細(xì)胞膜附近,初步表明BmBCRA在真核細(xì)胞中表達(dá)為膜蛋白。熒光定量PCR顯示,BmBCRA基因在家蠶馬氏體的轉(zhuǎn)錄水平最高,其次是中腸和性腺,頭部和低。馬氏管是昆蟲排泄的主要器官,說明BmBCRA蛋白可能在家蠶排泄系統(tǒng)里發(fā)揮重要作用。該基因RNA干擾后經(jīng)MT